Generatie van geïnduceerde neurale stamcellen uit perifere mononucleaire cellen en differentiatie naar precursoren voor Dopaminerge neuron voor transplantatie studies
Summary
Het protocol presenteert de herprogrammering van perifere bloed mononucleaire cellen voor het opwekken van neurale stamcellen door Sendai virus infectie, differentiatie van iNSCs in Dopaminerge neuronen, transplantatie van de voorlopers van de DA in de eenzijdig-lesioned De ziekte van Parkinson, en de evaluatie van de veiligheid en werkzaamheid van de in de SC afgeleide DA-precursoren voor PD-behandeling.
Abstract
De ziekte van Parkinson (PD) wordt veroorzaakt door degeneratie van Dopaminerge (DA) neuronen bij de Substantia nigra pars Compacta (SNpc) in de ventrale Mesencephalon (VM). Cel vervangende therapie heeft een grote belofte voor de behandeling van PD. onlangs, geïnduceerde neurale stamcellen (iNSCs) zijn ontstaan als een potentiële kandidaat voor cel vervangende therapie als gevolg van het verminderde risico van tumorvorming en de plasticiteit te geven aanleiding tot regiospecifieke neuronen en glia. iNSCs kunnen worden geherprogrammeerd vanuit autologe somatische cellulaire bronnen, zoals fibroblasten, perifere bloed mononucleaire cellen (Pbmnc’s) en verschillende andere soorten cellen. Vergeleken met andere soorten somatische cellen, zijn Pbmnc’s een aantrekkelijk starter celtype vanwege het gemak om te openen en uit te breiden in cultuur. Sendai virus (SeV), een RNA-niet-integratief virus, coderen van herprogrammeer factoren, waaronder Human OCT3/4, SOX2, KLF4 pt c-myc, heeft een negatief gevoel, enkel-streng, niet-gesegmenteerd genoom dat niet integreert in gastheer genoom, maar alleen repliceert in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen, het aanbieden van een efficiënt en veilig voertuig voor herprogrammering. In deze studie beschrijven we een protocol waarin iNSCs worden verkregen door het herprogrammeren van Pbmnc’s, en onderscheiden in gespecialiseerde VM DA neuronen door middel van een tweetraps methode. Dan worden DA-precursoren getransplanteerd in eenzijdig 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD-Muismodellen om de veiligheid en werkzaamheid voor de behandeling van PD te evalueren. Deze methode biedt een platform voor het onderzoeken van de functies en therapeutische effecten van patiënt-specifieke DA neurale cellen in vitro en in vivo.
Introduction
De ziekte van Parkinson (PD) is een gemeenschappelijke neurodegeneratieve aandoening, veroorzaakt door degeneratie van Dopaminerge (DA) neuronen bij de Substantia nigra pars Compacta (SNpc) in de ventrale Mesencephalon (VM), met een prevalentie van meer dan 1% in de populatie van meer dan 60 jaar oud 1 , 2. in de afgelopen tien jaar, cel therapie, gericht op hetzij het vervangen van de degeneratieve of beschadigde cellen, of het voeden van de micro omgeving rond de ontstellende neuronen, heeft aangetoond potentieel in de behandeling van PD3. Ondertussen heeft herprogrammeerings technologie aanzienlijke vooruitgang geboekt4, die een veelbelovende cellulaire bron voor vervangende therapie biedt. Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) en embryonale stamcellen (Esc’s) zijn bewezen in staat te zijn om te differentiëren in DA neurale cellen, die kunnen overleven, matureren en de motorische functies verbeteren wanneer ze worden geënt in rat en niet-humane primaat PD-modellen5 ,6,7,8. iPSCs vormen een mijlpaal in cellulaire herprogrammeer technologieën en hebben een groot potentieel in celtransplantatie; echter, er is nog steeds een bezorgdheid over het risico van tumorvorming van de niet volledig gedifferentieerde cellen. Een alternatieve cellulaire bron voor celtransplantatie is stamage-gepleegde volwassen stamcellen verkregen door directe herprogrammering, zoals geïnduceerde neurale stamcellen (iNSCs), die kunnen worden afgeleid van de instabiele tussen producten, het omzeilen van de pluripotentie etappe9,10,11.
Zowel ipscs als inscs kunnen worden geherprogrammeerd vanuit autologe cellulaire bronnen, zoals fibroblasten, perifere bloed mononucleaire cellen (pbmnc’s) en diverse andere soorten cellen12,13,14, waardoor de immunogeniciteit van getransplanteerde cellen in hoge mate. Bovendien, in vergelijking met iPSCs, iNSCs zijn inherent aan verminderde risico van tumorvorming en Lineage-geëngageerde plasticiteit, alleen in staat om te differentiëren in neuronen en glia11. In de eerste studies werden de ipscs en inscs van mensen of muizen gegenereerd uit fibroblasten verkregen uit huid biopsieën, wat een invasieve ingreep14,15is. Met dit respect zijn Pbmnc’s een aantrekkelijke starter celbron vanwege het minder invasieve bemonsteringsproces en het gemak om grote aantallen cellen te verkrijgen binnen een korte periode van expansie tijd16. Initiële herprogrammering studies gebruikt integratieve leveringssystemen, zoals lentivirale of retrovirale vectoren, die efficiënt en gemakkelijk te implementeren in vele soorten cellen17; Deze toedieningssystemen kunnen echter mutaties en reactivatie van residuele transgenen veroorzaken, die veiligheidsproblemen voor klinische therapeutische doeleinden12opleveren. Sendai virus (SeV) is een niet-integratief RNA-virus met een negatief gevoel, enkel-streng genoom dat niet wordt geïntegreerd in gastheer genoom, maar alleen repliceert in het cytoplasma van geïnfecteerde cellen, het aanbieden van een efficiënt en veilig voertuig voor herprogrammering18 ,19. Recombinant SeV vectoren zijn beschikbaar die herprogrammering factoren bevatten, waaronder Human OCT3/4, SOX2, KLF4 pt c-myc in hun open reading frames. Bovendien kunnen SeV-virale vectoren verder worden verbeterd door temperatuurgevoelige mutaties in te voeren, zodat ze snel kunnen worden verwijderd wanneer de cultuur temperatuur wordt verhoogd tot 39 °C20. In dit artikel beschrijven we een protocol voor het opnieuw programmeren van PBMNCs naar iNSCs met behulp van het SeV-systeem.
Veel studies hebben gemeld afleiding van da neuronen van menselijke ESCs of ipscs met behulp van verschillende methoden6,8,21. Er is echter een tekort aan protocollen die de differentiatie van DA-neuronen van iNSCs in Details beschrijven. In dit protocol beschrijven we de efficiënte generatie van DA neuronen van iNSCs met behulp van een tweetraps methode. De DA neuronale precursoren kunnen worden getransplanteerd in het striatum van PD Muismodellen voor de veiligheid en werkzaamheid evaluaties. Dit artikel zal een gedetailleerd protocol dat betrekking heeft op verschillende stadia van de generatie van geïnduceerde neurale stamcellen door Sendai virus, differentiatie van iNSCs in DA neuronen, oprichting van muis PD modellen, voor transplantatie van de voorlopers van de DA in het striatum presenteren. van de PD-modellen. Met dit protocol kan men iNSCs van patiënten en gezonde donoren genereren en DA-neuronen afleiden die veilig, standaardiseerbaar, schaalbaar en homogeen zijn voor celtransplantatie doeleinden, of voor het modelleren van PD in een gerecht en onderzoek van de mechanismen onderliggende ziekte aanvang en ontwikkeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteerden we een protocol dat verschillende stadia van iNSC-DA celtherapie voor PD-modellen bedekt. Kritieke aspecten van dit protocol zijn onder meer: (1) isolatie en uitbreiding van Pbmnc’s en herprogrammering van Pbmnc’s in iNSCs door SeV-infectie, (2) differentiatie van iNSCs naar DA neuronen, (3) oprichting van unilaterale 6-OHDA-lesioned PD Muismodellen en gedrags beoordeling, en (4) celtransplantatie van DA-precursoren en gedrags beoordeling.
In dit protocol omvat het eerste de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd gesteund door de volgende subsidies: stamcel-en vertaal nationaal sleutel project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 81561138004), gemeentelijke natuurwetenschappelijke Stichting van Peking (5142005), Beijing talents Foundation (2017000021223TD03), ondersteunend project van hoog niveau docenten in Beijing gemeentelijke universiteiten in de periode van de 13e vijf-jaar plan (CIT & TCD20180333), Beijing Medical System high level talent Award (2015-3-063), Beijing Gemeentelijke gezondheids Commissie Fonds (PXM 2018_026283_000002), Beijing 100, Thousand, en 10000 talenten Fund (2018A03), Beijing gemeentelijke administratie van ziekenhuizen klinische geneeskunde ontwikkeling van speciale steun (ZYLX201706), en de Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).
Materials
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20℃ |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβⅢ | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor βⅢ |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
Referências
- Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson’s disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, 2958-2969 (2009).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
- Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson’s Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
- Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
- Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson’s disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
- Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
- Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
- Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson’s disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
- Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
- Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).
