परिधीय मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से प्रेरित तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का उत्पादन और प्रत्यारोपण अध्ययन के लिए डोपामाइनर्जिक न्यूरोन Precursors की ओर भेदभाव
Summary
प्रोटोकॉल परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं के reprogramming प्रस्तुत करता है Sendai वायरस संक्रमण से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए, dopaminergic न्यूरॉन्स में iNSCs के भेदभाव, एकपक्षीय रूप में दा अग्रदूतों के प्रत्यारोपण पार्किंसंस रोग माउस मॉडल, और पीडी उपचार के लिए iNSC व्युत्पन्न डीए अग्रदूतों की सुरक्षा और प्रभावकारिता का मूल्यांकन.
Abstract
पार्किंसंस रोग (पीडी) अधर मेसेनसेफेलॉन (वीएम) में substantia नाइग्रा पारस कॉम्पैक्टा (SNpc) में डोपामाइनर्जिक (डीए) न्यूरॉन्स के अध: पतन के कारण होता है। कोशिका प्रतिस्थापन चिकित्सा पीडी के उपचार के लिए महान वादा रखती है. हाल ही में, प्रेरित तंत्रिका स्टेम सेल (iNSCs) ट्यूमर गठन के कम जोखिम और प्लास्टिक को जन्म देने के कारण सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी के लिए एक संभावित उम्मीदवार के रूप में उभरा है क्षेत्र-विशिष्ट न्यूरॉन्स और ग्लिया. iNSCs ऐसे फाइब्रोब्लास्ट्स, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMNCS) और कोशिकाओं के विभिन्न अन्य प्रकार के रूप में autologous कायिक सेलुलर स्रोतों से reprogrammed किया जा सकता है. दैहिक कोशिकाओं के अन्य प्रकार के साथ तुलना में, PBMNCS एक आकर्षक स्टार्टर सेल प्रकार के कारण उपयोग और संस्कृति में विस्तार करने के लिए आसानी से कर रहे हैं. Sendai वायरस (SeV), एक आरएनए गैर एकीकृत वायरस, मानव OCT3/4सहित reprogramming कारकों एन्कोडिंग , SOX2, KLF4 और सी-MYC, एक नकारात्मक भावना है, एकल फैला हुआ, गैर खंडित जीनोम है कि में एकीकृत नहीं करता है मेजबान जीनोम, लेकिन केवल संक्रमित कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में प्रतिकृति, reprogramming के लिए एक कुशल और सुरक्षित वाहन की पेशकश की. इस अध्ययन में, हम एक प्रोटोकॉल जिसमें iNSCs PBMNCS reprogramming द्वारा प्राप्त कर रहे हैं का वर्णन, और एक दो चरण विधि द्वारा विशेष वी एम डीए न्यूरॉन्स में विभेदित. फिर डीए अग्रदूतों एकतरफा में प्रत्यारोपित कर रहे हैं 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-लशने पीडी माउस मॉडल की सुरक्षा और पीडी के उपचार के लिए प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए. इस विधि के कार्यों और इन विट्रो में और विवो में रोगी विशेष दा तंत्रिका कोशिकाओं के चिकित्सीय प्रभाव की जांच करने के लिए एक मंच प्रदान करता है।
Introduction
पार्किंसंस रोग (पीडी) एक आम neurodegenerative विकार है, dopaminergic के अध: पतन के कारण (डीए) substantia nigra pars compacta (SNpc) में अधर मेसेनसेफेलॉन (VM), उम्र के 60 से अधिक वर्षों में जनसंख्या में 1% से अधिक की व्यापकता के साथ 1 , 2. पिछले दशक में, सेल थेरेपी, या तो अपक्षयी या क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की जगह, या degenerating न्यूरॉन्स के आसपास microenvironment पोषण के उद्देश्य से, पीडी3के उपचार में क्षमता दिखाई है. इस बीच, reprogramming प्रौद्योगिकी महत्वपूर्ण प्रगति की है4, जो प्रतिस्थापन चिकित्सा के लिए एक आशाजनक सेलुलर स्रोत प्रदान करता है. मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) और भ्रूण स्टेम सेल (ESCs) डीए तंत्रिका कोशिकाओं में अंतर करने में सक्षम होने के लिए सिद्ध किया गया है, जो जीवित रह सकता है, परिपक्वता, और मोटर कार्यों में सुधार जब चूहे और गैर मानव प्राइमेट पीडी मॉडल में grafted5 ,6,7,8. iPSCs सेलुलर reprogramming प्रौद्योगिकियों में एक मील का पत्थर का प्रतिनिधित्व करते हैं और सेल प्रत्यारोपण में एक महान क्षमता है; हालांकि, अभी भी अपूर्ण रूप से विभेदित कोशिकाओं से ट्यूमर गठन के जोखिम के बारे में चिंता है। सेल प्रत्यारोपण के लिए एक वैकल्पिक सेलुलर स्रोत वंश प्रतिबद्ध वयस्क स्टेम कोशिकाओं प्रत्यक्ष reprogramming के माध्यम से प्राप्त की है, इस तरह के प्रेरित तंत्रिका स्टेम सेल (iNSCs) के रूप में, जो अस्थिर मध्यवर्ती से प्राप्त किया जा सकता है, pluripotency को दरकिनार चरण9,10,11.
दोनों iPSCs और iNSCs autologous सेलुलर स्रोतों से reprogrammed किया जा सकता है, जैसे फाइब्रोब्लास्ट्स, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMNCS) और कोशिकाओं के विभिन्न अन्य प्रकार12,13,14, इस प्रकार को कम करने एक महान डिग्री करने के लिए प्रतिरोपित कोशिकाओं की इम्यूनोजेनिकता। इसके अलावा, iPSCs के साथ तुलना में, iNSCs ट्यूमर गठन और वंश प्रतिबद्ध plasticity के कम जोखिम के साथ निहित हैं, केवल न्यूरॉन्स और glia11में अंतर करने में सक्षम. प्रारंभिक अध्ययन में, मानव या माउस iPSCs और iNSCs त्वचा बायोप्सी से प्राप्त फाइब्रोब्लास्ट्स से उत्पन्न किए गए थे, जो एक आक्रामक प्रक्रिया है14,15. इस संबंध में, PBMNCs कम इनवेसिव नमूना प्रक्रिया की वजह से एक आकर्षक स्टार्टर सेल स्रोत हैं, और विस्तार समय16की एक छोटी अवधि के भीतर कोशिकाओं की बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए आसानी . प्रारंभिक reprogramming अध्ययन एकीकृत वितरण प्रणाली कार्यरत, जैसे lentiviral या retroviral वेक्टर्स, जो कुशल और कोशिकाओं के कई प्रकार में लागू करने के लिए आसान कर रहे हैं17; तथापि, ये वितरण प्रणालियां अवशिष्ट ट्रांसजीन्स के उत्परिवर्तन और पुनः सक्रियण का कारण बन सकती हैं, जो नैदानिक चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए सुरक्षा के मुद्दों को प्रस्तुत करतीहैं 12. Sendai वायरस (SeV) एक नकारात्मक भावना के साथ एक गैर एकीकृत आरएनए वायरस है, एकल फैला जीनोम है कि मेजबान जीनोम में एकीकृत नहीं करता है, लेकिन केवल संक्रमित कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में प्रतिकृति, 18 reprogramming के लिए एक कुशल और सुरक्षित वाहन की पेशकश ,19. Recombinant SeV सदिश उपलब्ध हैं कि मानव OCT3/4सहित reprogramming कारक होते हैं, SOX2, KLF4 और c-MYC उनके खुले पढ़ने फ्रेम में. इसके अलावा, सेव वायरल सदिशों को तापमान के प्रति संवेदनशील उत्परिवर्तनों को शुरू करके और सुधार किया जा सकता है, ताकि जब संस्कृति का तापमान 39 डिग्री सेल्सियस20तक बढ़ाया जाए तो उन्हें तेजी से हटाया जा सके। इस आलेख में, हम SeV सिस्टम का उपयोग कर iNSCs के लिए PBMNCS reprogram करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
कई अध्ययनों से विभिन्न विधियों 6,8,21का उपयोग करते हुए मानव ईएससी या आई पी एस सी से डीए न्यूरॉन्स के व्युत्पत्ति की सूचना मिली है . हालांकि, विवरण में आईएनएससी से डीए न्यूरॉन्स के भेदभाव का वर्णन प्रोटोकॉल की कमी है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक दो चरण विधि का उपयोग iNSCs से दा न्यूरॉन्स के कुशल पीढ़ी का वर्णन करेंगे. डीए न्यूरोनल अग्रदूतों सुरक्षा और प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए पीडी माउस मॉडल के striatum में प्रत्यारोपित किया जा सकता है. यह लेख एक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि Sendai वायरस द्वारा प्रेरित तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी से विभिन्न चरणों को शामिल किया जाएगा, डीए न्यूरॉन्स में iNSCs के भेदभाव, माउस पीडी मॉडल की स्थापना, striatum में डीए अग्रदूतों के प्रत्यारोपण के लिए पीडी मॉडल की. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, एक रोगियों और स्वस्थ दाताओं से iNSCs उत्पन्न कर सकते हैं और दा न्यूरॉन्स कि सुरक्षित हैं प्राप्त, मानक योग्य, स्केलेबल और सेल प्रत्यारोपण प्रयोजनों के लिए सजातीय, या एक डिश में पीडी मॉडलिंग और तंत्र की जांच के लिए अंतर्निहित रोग शुरुआत और विकास.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम एक प्रोटोकॉल है कि पीडी मॉडल के लिए iNSC-डीए सेल थेरेपी के विभिन्न चरणों को कवर प्रस्तुत किया. इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलुओं में शामिल हैं: (1) अलगाव और PBMNCS के विस्तार और SeV संक्रमण द्वारा iNSCs में PBMNCs ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
काम निम्नलिखित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: स्टेम सेल और अनुवाद राष्ट्रीय कुंजी परियोजना (2016YFA0101403), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81661130160, 81422014, 81561138004), बीजिंग नगर प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (5142005), बीजिंग प्रतिभा फाउंडेशन (201700002123TD03), 13 वीं पंचवर्षीय योजना की अवधि में बीजिंग नगर विश्वविद्यालयों में उच्च स्तरीय शिक्षकों की सहायता परियोजना (सीआईटी और TCD20180333), बीजिंग चिकित्सा प्रणाली उच्च स्तरीय प्रतिभा पुरस्कार (2015-3-063), बीजिंग नगर स्वास्थ्य आयोग कोष (PXM 2018]026283 ]000002), बीजिंग एक सौ, हजार, और दस हजार प्रतिभा कोष (2018A03), अस्पतालों नैदानिक चिकित्सा विकास के बीजिंग नगर प्रशासन विशेष वित्त पोषण सहायता ($YLX201706), और रॉयल सोसायटी-न्यूटन एडवांस्ड फैलोशिप (NA150482).
Materials
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20℃ |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβⅢ | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor βⅢ |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
Referências
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