Nós descrevemos procedimentos para processar o tecido recém-nascido do cérebro do rato para obter micrografias de elétron high-resolution para a Análise morfométrica da distribuição sináptica do vesícula em terminais do nervo. As micrografias obtidas com esses métodos também podem ser utilizadas para estudar a morfologia de uma série de outros componentes celulares e suas relações estruturais dimensionais.
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Artigo de método
Preparação do tecido cerebral de rato recém-nascido para Análise morfométrica ultraestrutural da distribuição de vesículas sinápticas em terminais nervosos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nosso laboratório e muitos outros exploraram o alto poder de resolução da microscopia eletrônica de transmissão para estudar a morfologia e a organização espacial das vesículas sinápticas. A fim de obter micrografias de elétrons de alta qualidade que podem produzir o grau de detalhe morfológico necessário para a análise quantitativa da distribuição de vesículas pré-sinápticas, a preparação ideal do espécime é crítica. A fixação química é o primeiro passo no processo de preparação de amostras, e de extrema importância para preservar a ultraestrutura fina. A fixação vascular com uma solução de glutaraldeído-formaldeído, seguida pelo tratamento de espécimes seccionados com vibratoma com tetroxida de ósmio, estabiliza o número máximo de moléculas, especialmente proteínas e lipídios, e resulta em conservação superior de ultrastructure. O tecido é então processado com a contrcoloração, desidratação sequencial e incorporação de resina. A coloração do bloco de en com acetato de uranilo (isto é, coloração do tecido vibratome-seccionado antes da incorporação da resina) realça o contraste endógeno e estabiliza componentes da pilha de encontro à extração durante o processamento do espécime. O contraste pode ser aumentado ainda mais aplicando o acetato do uranilo como uma borne-mancha em seções ultrafinos. A coloração dupla de secções ultrafinos com citrato de chumbo após o tratamento com acetato de uranilo também melhora a resolução da imagem, intensificando a opacidade de elétrons de estruturas contendo ácidos nucleicos através de ligação seletiva de chumbo ao acetato de uranilo. A microscopia eletrônica de transmissão é uma ferramenta poderosa para caracterização dos detalhes morfológicos das vesículas sinápticas e quantificação de seu tamanho e organização espacial no Bouton terminal. No entanto, por usar tecido fixo, a microscopia eletrônica de transmissão só pode fornecer informações indiretas sobre os processos de vida ou evolução. Portanto, outras técnicas devem ser consideradas quando o objetivo principal é estudar aspectos dinâmicos ou funcionais do tráfico de vesículas sinápticas e da exocitose.
Introdução
Nós descrevemos métodos para a preparação do tecido de cérebro recém-nascido do rato para obter micrografias de elétron de alta qualidade para a Análise morfométrica detalhada da distribuição espacial do vesícula sináptica em terminais do nervo1,2. As micrografias de alto contraste que podem ser obtidas pelo processamento de espécimes seguindo esses métodos também podem ser utilizadas para estudar a morfologia detalhada de um número de componentes celulares e suas relações estruturais dimensionais3,4.
O microscópio eletrônic....
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Protocolo
Todos os estudos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Virginia (Charlottesville, VA) e conduzidos de acordo com as diretrizes dos institutos nacionais de saúde.
1. fixação por perfusão vascular
Nota: Uma descrição geral do método de perfusão vascular cerebral de ratos já foi detalhada nesta revista13 e está além do escopo deste protocolo. No entanto, as etapas a seguir são específicas para a preparação do tecido cerebral de ratos recém-nascidos para obter micrografias de elétrons de alta qualidade para análise quantitativa....
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Resultados
Os critérios gerais que são aceitados na maior parte como indicativos da preservação satisfatória ou defeituosa do espécime para o tem foram estabelecidos. Estes critérios são exemplificados em quatro micrografias de elétron selecionados (dois exemplos da preparação óptima, dois exemplos da preparação defeituosa) que foram obtidos tratando o tecido de cérebro novo do rato que segue os métodos descritos neste protocolo.
Em geral, uma micrografia eletrônica de boa qualidade aparece como uma imag.......
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Discussão
A manipulação de seções do tecido durante a preparação do espécime para o TEM exige um grau considerável de finesse, de concentração e de paciência. Ao usar uma micropipeta para adicionar e remover soluções, os espécimes podem ser sugados na ponta da pipeta pela tensão de superfície, tão grande cuidado deve ser tomado para evitar dano de tecido pela pipeta. Também, determinadas etapas da seqüência da desidratação podem ser tão rápidas quanto 1 minuto, daqui o operador precisa de trabalhar rapidamente para assegurar-se de.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este manuscrito foi apoiado por NIH/NIGMS K08 123321 (para a) e por fundos do departamento de Anestesiologia da Universidade da Virgínia. Os autores desejam agradecer a alev Erisir (departamento de biologia, Universidade da Virgínia, Charlottesville, VA) por excelente treinamento e assistência técnica com a TEM, e por sua inestimável crítica manuscrita. Os autores igualmente agradecem a facilidade avançada da microscopia de elétron na Universidade de Virgínia para a assistência técnica com seccionamento do espécime e borne-mancha.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4% Tetróxido de Ósmio | Microscopia Eletrônica Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldeído | Microscopia Eletrônica Sciences | 16310 | Grau EM, acqueous |
| Aclar 33 C filme de incorporação | Microscopia Eletrônica Sciences | 50425-25 | 7.8 mil espessura, tamanho 8"x10" |
| BEEM porta-cápsulas Electron | Microscopy Sciences | 69916 | detém tamanho "00" cápsulas |
| BEEM incorporando cápsulas | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "tamanho 00, plano (fundo cortado)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Pincel de pintura de pêlo | de camelo Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch Electron | Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Microscopia Eletrônica Ciências | 14120 | |
| Acetato de chumbo | Microscopia Eletrônica Ciências | 17600 | |
| Citrato de chumbo | Microscopia Eletrônica Ciências | 17800 | |
| Nitrato de chumbo | Microscopia eletrônica Ciências | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut micrótomo | Leica | ||
| Micro escala | Ciências de Microscopia Eletrônica | 62091-23 | |
| Microscopia Eletrônica | de Paraformaldeído | 19208 | Grau EM, granular |
| Forno de laboratório Thelco de precisão Thelco | 51221159 | ||
| Azida de sódio | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| Caneta StatMark | Ciências de Microscopia Eletrônica | 72109-01 | |
| Solução de Tyrode | Microscopia eletrônica Sciences | 11760-05 | |
| Acetato de uranilo | Microscopia Eletrônica Sciences | 22400 | pó |
Referências
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V.
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Reimpressões e permissões
