Verwendung der wirbellosen Galleria mellonella als Infektionsmodell zur Untersuchung des Mycobacterium tuberculosis Complex
Summary
Galleria mellonella wurde vor kurzem als reproduzierbares, billiges und ethisch akzeptables Infektionsmodell für den Mycobacterium tuberculosis-Komplex etabliert. Hier beschreiben und zeigen wir die Schritte, die unternommen wurden, um eine erfolgreiche Infektion von G. mellonella mit biolumineszierendem Mycobacterium bovis BCG lux zu etablieren.
Abstract
Tuberkulose ist die weltweit führende Ursache für die Sterblichkeit von Infektionskrankheiten und etwa ein Viertel der Weltbevölkerung wird angenommen, dass sie mit Mycobacterium tuberculosisinfiziert ist. Trotz jahrzehntelanger Forschung müssen viele der Mechanismen hinter dem Erfolg von M. tuberculosis als pathogener Organismus noch untersucht werden, und die Entwicklung sichererer, wirksamerer antimykobakterieller Medikamente ist dringend erforderlich, um dem Anstieg und der Ausbreitung der medikamentenresistenten Tuberkulose. Das Fortschreiten der Tuberkuloseforschung wird jedoch durch traditionelle Säugetierinfektionsmodelle, die teuer, zeitaufwändig und ethisch anspruchsvoll sind, in einen Engpass gesteckt. Zuvor haben wir die Larven des Insekts Galleria mellonella (größere Wachsmotte) als neuartiges, reproduzierbares, kostengünstiges, hochdurchlässiges und ethisch akzeptables Infektionsmodell für Mitglieder des M. tuberculosis-Komplexes etabliert. Hier beschreiben wir die Erhaltung, Zubereitung und Infektion von G. mellonella mit biolumineszierendem Mycobacterium bovis BCG lux. Mit diesem Infektionsmodell kann eine mykobakterielle dosisabhängige Virulenz beobachtet werden, und eine schnelle Auslesung der in vivo mykobakteriellen Belastung mittels Biolumineszenzmessungen ist leicht erreichbar und reproduzierbar. Obwohl es Einschränkungen gibt, wie das Fehlen eines vollständig kommentierten Genoms für die transkriptomische Analyse, kann eine ontologische Analyse gegen genetisch ähnliche Insekten durchgeführt werden. Als kostengünstiges, schnelles und ethisch akzeptables Modell für Tuberkulose kann G. mellonella als Vorscreen verwendet werden, um die Wirksamkeit und Toxizität von Arzneimitteln zu bestimmen und die vergleichende mykobakterielle Virulenz vor der Anwendung konventioneller Säugetiere zu bestimmen. Modelle. Die Verwendung des G. mellonella-Mykobakterien-Modells wird zu einer Verringerung der beträchtlichen Anzahl von Tieren führen, die derzeit in der Tuberkuloseforschung verwendet werden.
Introduction
Tuberkulose (TB) stellt eine große Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit dar, mit 9 Millionen neuen Fällen pro Jahr und 1,5 Millionen Todesfällen1. Darüber hinaus wird geschätzt, dass ein Viertel der Weltbevölkerung mit dem Erreger der Krankheit infiziert ist, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Unter der infizierten Bevölkerung werden 5 bis 10 % im Laufe ihres Lebens eine aktive TB-Krankheit entwickeln. Darüber hinaus stellt das Aufkommen und die Ausbreitung von multiresistentem (MDR) und extensiv-medikamentösem (XDR) resistentem Mtb eine ernste Bedrohung für die Seuchenbekämpfung dar, wobei 123 Länder mindestens einen XDR-Fallmelden 1. Die Behandlung von TB erfordert einen Cocktail von mindestens vier antimykobakteriellen Medikamenten, von denen Isoniazid und Rifampicin für eine Mindestdauer von sechs Monaten verschrieben werden; Behandlung ist oft mit komplexen Nebenwirkungen und Toxizitäten verbunden. Der Schutz vor dem einzigen zugelassenen Impfstoff gegen TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), ist variabel2. Ein unvollständiges Verständnis der Pathogenese von TB behindert die Entwicklung neuer Therapie- und Impfstrategien erheblich.
Seit Jahrzehnten sind Tierinfektionsmodelle für die TB-Forschung von entscheidender Bedeutung, um die grundlegende Pathogenese und die Wirtsreaktion auf Infektionen zu verstehen und neuartige antimykobakterielle Wirkstoffe, Immuntherapeutika und neue Impfstoffkandidaten zu bewerten3, 4. Die Forschung mit Tierinfektionsmodellen von TB ist jedoch notorisch schwierig, da die Pathogenese und das Fortschreiten der TB-Infektion komplex sind und es kein einzelnes Tiermodell gibt, das das gesamte Spektrum und wichtige Merkmale der Krankheit imitiert5 ,6. Darüber hinaus sind Tierversuche teuer, zeitaufwändig und erfordern eine vollständige ethische Rechtfertigung. Dennoch wurden Tierinfektionsmodelle von TB bei nichtmenschlichen Primaten (z. B. Makaken), Meerschweinchen, Kaninchen, Rindern, Schweinen, Mäusen und Zebrafischen beschrieben, wobei jeder seine Einschränkungenhat 3,4. Das murine Modell ist das am häufigsten verwendete Modell aufgrund von Kosten, Verfügbarkeit von inzuchtlinien, Reproduzierbarkeit der Infektion und Fülle von immunologischen Reagenzien. Sie bilden jedoch in der Regel keine Granulome, die mit Hypoxiegebieten assoziiert sind, die für eine latente Tuberkuloseinfektion (LTBI) charakteristisch sind (LTBI)6. Meerschweinchen sind sehr anfällig für Mtb-Infektionen, mit Pathologie und frühe Granulombildung ähnlich denen beim Menschen, und sind weit verbreitet in Impfstofftests verwendet; doch der Mangel an immunologischen Reagenzien behindert ihre Verwendung als Infektionsmodell7. Zebrafische eignen sich aufgrund ihrer geringen Größe, schnellen Fortpflanzung und fortgeschrittenen genetischen Werkzeuge für großangelegte Screenings in präklinischen Studien im Frühstadium, sind aber anatomisch und physiologisch verschieden vom Menschen und nur anfällig für Mycobacterium marinum Infektion3. Die Tiermodelle, die der menschlichen Mtb-Infektion am ehesten ähneln, sind nichtmenschliche Primaten (z.B. der Makaken), aber sie sind teuer und haben erhebliche ethische und praktische Überlegungen, die ihre Verwendung erheblich einschränkt8.
Die Insektenlarven der größeren Wachsmotte oder Wabenmotte,Galleria mellonella, sind als Infektionsmodell für eine Vielzahl von bakteriellen und Pilzpathogenen9und als Bildschirm für neuartige antimikrobielle Wirkstoffkandidaten immer beliebter geworden. 10. G. mellonella ist ein erfolgreiches Wirbellosenmodell aufgrund seines ausgeklügelten angeborenen Immunsystems (bestehend aus zellulären und humoralen Abwehrmaßnahmen), das einen hohen Grad an struktureller und funktioneller Ähnlichkeit mit dem von Wirbeltieren teilt11 . Dazu gehören Immunmechanismen wie die Phagozytose von Krankheitserregern durch Hämozyten (funktionell ähnlich wie Säugetiermakrophagen und Neutrophile)12,13, die Produktion und Zirkulation von antimikrobiellen Peptiden (AMPs) und Komplement-ähnliche Proteine innerhalb der Hämolymphe (analog zum Säugetierblut) von G. mellonella11. Weitere Vorteile9,14,15 von G. mellonella Larven als Modell sind 1) ihre große Größe (20 x 30 mm), die eine einfache Manipulation und Infektion ermöglicht, sowie die Sammlung von Gewebe und Hämolymphe für Analysen, 2) einfache Wartung bei 37 °C, kompatibel zur Untersuchung menschlicher Krankheitserreger, 3) präzise Injektion ohne Anästhesie, 4) Wirksamkeit antimikrobieller Wirkstoffe kann mit weniger Wirkstoff zur Bewertung beurteilt werden, 5) Mangel an ethische Zwänge im Vergleich zur Verwendung von Säugetieren, 6) große Gruppengrößen können im Vergleich zu Tiermodellen verwendet werden, die eine größere Reproduzierbarkeit ermöglichen, und 7) kürzere Zeiten für Infektionsexperimente sind erforderlich.
In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass G. mellonella als neuartiges Infektionsmodell zur Untersuchung der Pathogenese von Infektionen durch biolumineszierende M. bovis BCG lux, eine genetisch veränderte Version des Impfstoffstamms und des Mtb-Komplexes (MTBC)16. Während G. mellonella bisher als Infektionsmodell für nicht-tuberkulöse Mykobakterien (NTM) verwendet wurde, sind vor allem M. marinum und Mycobacterium abscessus17,18, Studien mit MTBC auf die von Li et al.16. Biolumineszierende nichtpathogene mykobakterielle Stämme, die auf Containment-Ebene (CL) 2 als Ersatz für Mtb eingesetzt werden können, bieten die Vorteile von Sicherheit und Praktikabilität gegenüber pathogenen Mykobakterien. Nach der Infektion mit BCG luxbeginnen Larven, frühe granulomähnliche Strukturen zu entwickeln, die wertvolle Einblicke in die Rolle der angeborenen Immunität bei der Etablierung einer TB-Infektion bieten könnten16. Darüber hinaus hat dieses einfache Modell für wirbellose Infektionen das Potenzial, eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Bewertung der TB-Pathogenese zu ermöglichen, die eine kontrollierte Herausforderung und mehrere Replikationen zur Reproduzierbarkeit umfasst. Darüber hinaus hat das Modell das Potenzial, in der frühen Entwicklung neue Anti-TB-Medikamente und Impfstoffkandidaten zu testen, wodurch die Gesamtzahl der Versuchstiere reduziert wird. Die Fähigkeit, Veränderungen in der Wirts- und Pathogenstruktur, Transkriptom und Proteom zu messen, um Arzneimittelziele zu bestimmen und Wirkmechanismen neuartiger Medikamente und therapeutischer Impfstoffe zu bewerten, ist ebenfalls von Vorteil.
Hier beschreiben wir die experimentellen Protokolle zur Herstellung eines biolumineszierenden M. bovis BCG lux inoculum und G. mellonella larven für mykobakterielle Infektionen, sowie die Bestimmung von Larven und mykobakteriellen Überleben als Reaktion auf eine Infektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von G. mellonella als Infektionsmodell wurde für eine Reihe von bakteriellen und Pilzpathogenen für die Untersuchung von Virulenz, Wirt-Pathogen-Interaktion, und als Bildschirm für neuartige Therapeutika10,22etabliert. Die folgende Diskussion basiert auf dem experimentellen Verfahren zur Verwendung von G. mellonella als Infektionsmodell für die MTBC.
Die Gesundheit der naiven Larven vor dem…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse des Biotechnology and Biological Science Research Council (BBSRC) unterstützt, das PRL und YL (BB/P001262/1) und dem National Center for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) an PRL, SMN, BDR und YL (NC/R001596/1).
Materials
| 1.5ml reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 ml pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0ml) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µl, 25 ga) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
Referências
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