Vi beskriver en in-løsning metode for å bruke uniform skjær til blodplater overflaten reseptorer ved hjelp av membran-plate viskosimetri. Denne metoden kan også brukes mer generelt til å bruke skjær til andre celletyper og celle-fragmenter og trenger ikke å målrette et bestemt ligand-reseptor-par.
Mange biologiske celler/vev kjenne de mekaniske egenskapene til sine lokale miljøer via mechanoreceptors, proteiner som kan reagere på krefter som trykk eller mekanisk forstyrrelser. Mechanoreceptors oppdage sine stimuli og overføre signaler via et stort mangfold av mekanismer. Noen av de vanligste rollene for mechanoreceptors er i neuronal svar, som berøring og smerte, eller hårceller som fungerer i balanse og hørsel. Mechanosensation er også viktig for celletyper som regelmessig utsettes for skjær stress som endothelial celler, hvilken linje blodkar, eller blodceller som opplever skjær i normal sirkulasjon. Viskosimetre er enheter som oppdager viskositet av væsker. Rotasjons viskosimetre kan også brukes til å påføre en kjent skjærkraft på væsker. Evnen til disse instrumentene til å innføre ensartet skjær til væsker har blitt utnyttet til å studere mange biologiske væsker, inkludert blod og plasma. Viskosimetri kan også brukes til å søke skjær til cellene i en løsning, og å teste effekten av skjær på bestemte ligand-reseptor parene. Her bruker vi membran-plate viskosimetri å teste effekten av endogene nivåer av skjær stress på blodplater behandlet med antistoffer mot blodplater mechanosensory reseptoren komplekse GPIb-IX.
Mechanoreceptors er proteiner som reagerer på mekaniske stimuli, som trykk eller mekaniske forstyrrelsene/deformasjon. For noen mechanoreceptors, sensing disse mekaniske forstyrrelser er eksplisitt til funksjonen av celletyper som de er uttrykt. Ta for eksempel strekk reseptorene i baroreceptor neurons; disse mechanosensitive ion-kanaler regulerer blodtrykket ved sensing vaskulær “Stretch”1,2. I det indre øret oppdager ion-kanaler på hårceller mekaniske deformasjoner forårsaket av lydbølger3, og hud lav terskel Mechanoreceptors (LTMRs) Letter overføring av taktil informasjon4. I andre tilfeller, mechanoreceptors gi viktig informasjon til cellen for etablering av vedheft eller vekst. Celler kan fornemme stivhet i sitt lokale miljø, og kan stole på kontraktile styrker via utgangen cytoskeleton og integrins å diktere vekst eller spredning5,6.
Når man studerer reseptor-ligand interaksjoner i celle-eller vevs BAS ert modeller, finnes det felles analyser som raskt og nøyaktig kan rapportere virkningene av å endre temperatur, pH, ligand konsentrasjon, tonisitet, membran potensial, og mange andre parametre som kan variere i vivo. Men de samme analysene kan komme til kort når det gjelder å påvise bidrag av mekanisk kraft til reseptor aktivering. Enten cellene er sensing deres mikromiljøet, oppdage lydbølger, eller reagerer på strekk, en ting de nevnte mechanoreceptors har til felles er at de deltar i interaksjoner der ligand, reseptoren, eller begge, er forankret til en Overflaten. Analyser utviklet for å teste effekten av mekaniske krefter på reseptor interaksjoner gjenspeiler ofte dette paradigmet. Materialer og Flow kamre brukes til å studere virkningene av skjær flyt på celler og reseptorer7,8. Disse typer eksperimenter har fordelen av å tillate finjustering av skjær rater via etablerte strømningshastigheter. Andre teknikker ansette fluorescerende molekylære sonder for å oppdage krefter brukt av celler på ligand-rike overflater, gir en nøyaktig avlesning av omfanget og orientering av krefter involvert i samspillet9,10.
I tillegg til mechanosensation som oppstår der en eller begge partnerne er forankret til en overflate, kan skjær stress påvirke proteiner og celler i løsningen. Dette er ofte observert i blodceller/proteiner som er konstant i sirkulasjon, og kan manifestere via aktivering av mechanoreceptors som normalt overflate-forankret11, eller gjennom eksponering av mål sekvenser som ville være okkludert under statiske forhold12. Men relativt færre teknikker analysen effekten av skjærkraft på partikler i løsningen. Noen i løsningen tilnærminger innføre skjær via virvlingen celler i Fluid suspensjon med varierende hastigheter og varigheter, selv om disse tilnærmingene kan ikke tillate en svært presis bestemmelse av skjær stress generert. Rotasjons viskosimetre måler viskositet ved å påføre en spesifikk skjærkraft på væsker. Heri beskriver vi en anvendt metode for å bestemme effekten av bestemte laminær skjær priser på celler eller celle fragmenter i løsningen.
En av de mest uttrykte proteiner på blodplate overflaten er glykoprotein (GP) IB-IX-komplekset. GPIb-IX er primær reseptoren for plasma proteinet von Willebrand Factor (VWF). Sammen har dette reseptor-ligand paret lenge vært anerkjent som grunnlaget for plate responsen for å skjære stress13. I tilfelle vaskulær skade, VWF binder seg til eksponert kollagen i sub-endothelial matrise14, og dermed rekruttere blodplater til skadestedet via VWF-GPIB-IX interaksjon. VWF engasjement til sitt bindende område i GPIbα-delenhet hvis GPIb-IX under fysiologisk skjærbelastning induserer utfoldelsen av en membran-proksimale mechanosensory domene (MSD) som i sin tur aktiverer GPIb-IX15. I en fersk studie har vi vist at antistoffer mot GPIbα, som de som genereres i mange immun trombocytopeni (ITP) pasienter, er også i stand til å indusere blodplater signalering via MSD utfolder seg under skjær stress11. Men i motsetning til VWF, som letter skjær indusert GPIb-IX-aktivering ved å immobilizing komplekset under normal sirkulasjon, er de bivalent Antistoffene i stand til å krysskobling blodplater via GPIb-IX og utfolde MSD i omløp. På denne måte, en mechanoreceptor hvilke er normalt aktivert av overflate immobilisering under klipping kan aktivert inne løsning. I denne rapporten, vil vi demonstrere hvordan en kapillærviskosimeteret-basert uniform skjær analysen ble utnyttes til å oppdage virkningene av bestemte nivåer av skjær stress på reseptor aktivering i løsningen.
Protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet gir rask og allsidig vurdering av effekten av laminær skjær på blodplater og celleoverflaten reseptorer. Den spesifikke representative resultatene som presenteres her understreker hvordan virkningene av multimeric eller bivalent ligander kan påvirkes av skjær flyt. I tillegg til dette programmet, en enhetlig skjær analysen har brede anvendelser i observere skjær-avhengige effekter. I fravær av en kjent ligand-reseptor par, en enhetlig skjær analysen kan også opp…
The authors have nothing to disclose.
Arbeid relevant for denne studien ble støttet delvis av National Institutes of Health (NIH) National Heart, Lung, og Blood Institute tilskudd HL082808, HL123984 (R.L.), og F31HL134241 (M.E.Q.). Finansiering også levert av NIH National Institute of General Medical Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); og pilot stipend midler fra Children ‘ s Healthcare av Atlanta og Emory University pediatric Flow flowcytometri Core. Forfatterne vil gjerne takke Dr. hans Deckmyn for deling av 6B4 antistoff, og Emory Children ‘ s pediatric Research Center Flow flowcytometri Core for teknisk støtte.
APC anti-human CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
Brookfield Cap 2000+ Viscometer | Brookfield | – | |
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
Pooled Normal Human Plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) | BD | 369714 | |
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle | BD | 367287 |