En ensartet Forskydningsanalyse for humant trombocyttal og celleoverflade receptorer via kegle-plade Viscometry
Summary
Vi beskriver en in-Solution metode til at anvende ensartet forskydning til blodplade overflade receptorer ved hjælp af kegle-plade viscometri. Denne metode kan også bruges mere bredt til at anvende shear til andre celletyper og celle-fragmenter og behøver ikke at målrette en specifik ligand-receptor par.
Abstract
Mange biologiske celler/væv fornemmer de mekaniske egenskaber i deres lokale miljøer via mekanisoreceptorer, proteiner, der kan reagere på kræfter som tryk eller mekaniske forstyrrelser. Mechanoreceptors opdager deres stimuli og sender signaler via en stor mangfoldighed af mekanismer. Nogle af de mest almindelige roller for mechanoreceptors er i neuronal svar, som touch og smerte, eller hårceller, der fungerer i balance og hørelse. Mechanosensation er også vigtigt for celletyper, der jævnligt udsættes for forskydnings stress såsom endotelceller, hvilke linje blodkar eller blodlegemer, der oplever forskydning i normal cirkulation. Viscometers er enheder, der detekterer viskositeten af væsker. Rotational viskosimetre kan også anvendes til at anvende en kendt forskydningskraft på væsker. Evnen af disse instrumenter til at indføre en ensartet forskydning til væsker er blevet udnyttet til at studere mange biologiske væsker, herunder blod og plasma. Viscometry kan også anvendes til at anvende shear til cellerne i en opløsning, og til at teste virkningerne af shear på specifikke ligand-receptor-par. Her udnytter vi kegle-plade viskometri til at teste virkningerne af endogene niveauer af forskydnings stress på blodplader behandlet med antistoffer mod trombocytsensorisk receptor kompleks gpib-IX.
Introduction
Mechanoreceptors er proteiner, der reagerer på mekaniske stimuli, såsom tryk eller mekanisk perturbation/deformation. For nogle mechanoreceptorer, sensing disse mekaniske forstyrrelser er eksplicit til funktionen af de celletyper, som de er udtrykt. Tag for eksempel de stræk receptorer i baroreceptor neuroner; disse mekanisofølsomme Ionkanaler regulerer blodtrykket ved at registrere vaskulær “stretch”1,2. I det indre øre, ionkanaler på hårceller detekterer mekaniske deformationer forårsaget af lydbølger3, og kutane lav tærskel mekanisoreceptorer (ltmrs) lette overførslen af taktile information4. I andre tilfælde, mekanioreceptors give vigtige oplysninger til cellen for etablering af vedhæftning eller vækst. Celler kan fornemme stivheden i deres lokale miljø, og kan stole på kontraktile kræfter via actin cytoskelet og integrins at diktere vækst eller sprede6,5.
Når man studerer receptor-ligand interaktioner i celle-eller vævsbaserede modeller, findes der fælles analyser, som hurtigt og præcist kan rapportere virkningerne af at ændre temperatur, ph, ligand koncentration, tonicitet, membran potentiale, og mange andre parametre der kan variere in vivo. Men, disse samme analyser kan falde kort, når det kommer til at afsløre bidrag af mekanisk kraft til receptor aktivering. Uanset om cellerne registrerer deres mikromiljø, detekterer lydbølger eller reagerer på stretch, er en ting, som førnævnte mekanisoreceptorer har til fælles, at de deltager i interaktioner, hvor ligand, receptoren eller begge er forankret til en Overflade. Assays udviklet til at teste virkningerne af mekaniske kræfter på receptor interaktioner ofte afspejler dette paradigme. Mikrofluidics og flow kamre bruges til at studere virkningerne af forskydnings strøm på celler og receptorer7,8. Disse typer af eksperimenter har den fordel at tillade finjustering af forskydnings hastigheder via etablerede strømningshastigheder. Andre teknikker anvender fluorescerende molekylære sonder til at detektere kræfter, der påføres af celler på ligand-rige overflader, hvilket giver en nøjagtig aflæsning af omfanget og orienteringen af kræfter, der er involveret i interaktionen9,10.
Ud over mekanisk sensation, hvor den ene eller begge parter er forankret til en overflade, kan forskydnings stress påvirke proteiner og celler i opløsning. Dette observeres ofte i blodceller/proteiner, der konstant er i omløb, og kan manifestere sig via aktivering af mekanisoreceptorer, der normalt er overflade forankrede11, eller ved eksponering af målsekvenser, som ville blive tilstoppet under statiske forhold12. Men relativt færre teknikker assay virkningerne af forskydningskraft på partikler i opløsning. Nogle in-Solution tilgange introducere shear via vortexning celler i flydende suspension med varierende hastigheder og varighed, selv om disse tilgange kan ikke tillade en meget præcis bestemmelse af forskydningen stress genereret. Roterende viskosimetre måler viskositet ved at anvende en specifik forskydningskraft på væsker. Heri beskriver vi en anvendt metode til bestemmelse af effekten af specifikke laminar forskydnings rater på celler eller celle fragmenter i opløsning.
Et af de mest højt udtrykte proteiner på trombocytoverfladen er glykoprotein (GP) Ib-IX-komplekset. GPIb-IX er den primære receptor for plasmaprotein von Willebrand Factor (VWF). Sammen, denne receptor-ligand par har længe været anerkendt som grundlaget for trombocyttal respons til shear stress13. I tilfælde af vaskulære skader binder VWF sig til eksponeret kollagen i sub-Endothelial matrix14, hvorved der rekrutteres blodplader til skadestedet via vWF-GPIb-IX-interaktionen. VWF engagement i dets bindingssted i GPIbα-under enheden, hvis GPIb-IX under fysiologisk forskydnings stress inducerer udtrækning af et membran-proximalt mechanosensoriske domæne (MSD), som igen aktiverer GPIb-IX15. I en nylig undersøgelse har vi vist, at antistoffer mod GPIbα, som dem, der dannes hos mange patienter med immun trombocytopeni (ITP), også kan inducere trombocytsignalering via MSD, der udfolder sig under forskydnings stress11. I modsætning til VWF, som letter aktivering af forskydnings induceret GPIb-IX ved at immobilisere komplekset under normal cirkulation, er de bivalente antistoffer i stand til at kryds forbinde trombocytterne via GPIb-IX og udfolde MSD i omløb. På denne måde kan en mekanisoreceptor, som normalt aktiveres ved overflade immobilisering under forskydning, aktiveres i opløsningen. I denne rapport, vil vi demonstrere, hvordan en viscometer-baseret ensartet forskydningsanalyse blev gearede til at påvise virkningerne af specifikke niveauer af forskydnings stress på receptor aktivering i opløsning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den protokol, der er beskrevet i dette manuskript, giver mulighed for hurtig og alsidig vurdering af effekten af laminar forskydning på blodplade-og celleoverflade receptorer. De specifikke repræsentative resultater præsenteret her understreger, hvordan virkningerne af multimeriske eller bivalent ligander kan påvirkes af forskydnings strøm. Ud over denne applikation, en ensartet forskydningsanalyse har brede anvendelsesmuligheder i observation forskydnings afhængige effekter. I mangel af et kendt ligand-receptor pa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejde, der er relevant for denne undersøgelse, blev delvist støttet af National Institutes of Health (NIH) national Heart, Lung og Blood Institute giver HL082808, HL123984 (R.L.), og F31HL134241 (M.E.Q.). Støtte ydet af NIH National Institute of General Medical Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); og pilot tilskud midler fra children’s Healthcare af Atlanta og Emory University Pediatric flow cytometry Core. Forfatterne vil gerne takke Dr. hans Deckmyn for at dele 6B4 antistof, og Emory children’s Pediatric Research Center flow cytometry Core for teknisk support.
Materials
| APC anti-human CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ Viscometer | Brookfield | – | |
| FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Pooled Normal Human Plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) | BD | 369714 | |
| Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle | BD | 367287 |
Referências
- Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).
- Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
- Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).
- Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).
- Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).
- Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
- Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
- Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131 (7), 787-796 (2018).
- Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).
- Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
- Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).
- Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
- Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).
- Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. . Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , (2010).
- Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).
- Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).
- Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).
- Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).
