En uniform Shear analysen for humant blodplater og Cell Surface reseptorer via Cone-plate Viskosimetri

Summary

Vi beskriver en in-løsning metode for å bruke uniform skjær til blodplater overflaten reseptorer ved hjelp av membran-plate viskosimetri. Denne metoden kan også brukes mer generelt til å bruke skjær til andre celletyper og celle-fragmenter og trenger ikke å målrette et bestemt ligand-reseptor-par.

Abstract

Mange biologiske celler/vev kjenne de mekaniske egenskapene til sine lokale miljøer via mechanoreceptors, proteiner som kan reagere på krefter som trykk eller mekanisk forstyrrelser. Mechanoreceptors oppdage sine stimuli og overføre signaler via et stort mangfold av mekanismer. Noen av de vanligste rollene for mechanoreceptors er i neuronal svar, som berøring og smerte, eller hårceller som fungerer i balanse og hørsel. Mechanosensation er også viktig for celletyper som regelmessig utsettes for skjær stress som endothelial celler, hvilken linje blodkar, eller blodceller som opplever skjær i normal sirkulasjon. Viskosimetre er enheter som oppdager viskositet av væsker. Rotasjons viskosimetre kan også brukes til å påføre en kjent skjærkraft på væsker. Evnen til disse instrumentene til å innføre ensartet skjær til væsker har blitt utnyttet til å studere mange biologiske væsker, inkludert blod og plasma. Viskosimetri kan også brukes til å søke skjær til cellene i en løsning, og å teste effekten av skjær på bestemte ligand-reseptor parene. Her bruker vi membran-plate viskosimetri å teste effekten av endogene nivåer av skjær stress på blodplater behandlet med antistoffer mot blodplater mechanosensory reseptoren komplekse GPIb-IX.

Introduction

Mechanoreceptors er proteiner som reagerer på mekaniske stimuli, som trykk eller mekaniske forstyrrelsene/deformasjon. For noen mechanoreceptors, sensing disse mekaniske forstyrrelser er eksplisitt til funksjonen av celletyper som de er uttrykt. Ta for eksempel strekk reseptorene i baroreceptor neurons; disse mechanosensitive ion-kanaler regulerer blodtrykket ved sensing vaskulær “Stretch”^1,2. I det indre øret oppdager ion-kanaler på hårceller mekaniske deformasjoner forårsaket av lydbølger³, og hud lav terskel Mechanoreceptors (LTMRs) Letter overføring av taktil informasjon⁴. I andre tilfeller, mechanoreceptors gi viktig informasjon til cellen for etablering av vedheft eller vekst. Celler kan fornemme stivhet i sitt lokale miljø, og kan stole på kontraktile styrker via utgangen cytoskeleton og integrins å diktere vekst eller spredning^5,6.

Når man studerer reseptor-ligand interaksjoner i celle-eller vevs BAS ert modeller, finnes det felles analyser som raskt og nøyaktig kan rapportere virkningene av å endre temperatur, pH, ligand konsentrasjon, tonisitet, membran potensial, og mange andre parametre som kan variere i vivo. Men de samme analysene kan komme til kort når det gjelder å påvise bidrag av mekanisk kraft til reseptor aktivering. Enten cellene er sensing deres mikromiljøet, oppdage lydbølger, eller reagerer på strekk, en ting de nevnte mechanoreceptors har til felles er at de deltar i interaksjoner der ligand, reseptoren, eller begge, er forankret til en Overflaten. Analyser utviklet for å teste effekten av mekaniske krefter på reseptor interaksjoner gjenspeiler ofte dette paradigmet. Materialer og Flow kamre brukes til å studere virkningene av skjær flyt på celler og reseptorer^7,8. Disse typer eksperimenter har fordelen av å tillate finjustering av skjær rater via etablerte strømningshastigheter. Andre teknikker ansette fluorescerende molekylære sonder for å oppdage krefter brukt av celler på ligand-rike overflater, gir en nøyaktig avlesning av omfanget og orientering av krefter involvert i samspillet^9,10.

I tillegg til mechanosensation som oppstår der en eller begge partnerne er forankret til en overflate, kan skjær stress påvirke proteiner og celler i løsningen. Dette er ofte observert i blodceller/proteiner som er konstant i sirkulasjon, og kan manifestere via aktivering av mechanoreceptors som normalt overflate-forankret¹¹, eller gjennom eksponering av mål sekvenser som ville være okkludert under statiske forhold¹². Men relativt færre teknikker analysen effekten av skjærkraft på partikler i løsningen. Noen i løsningen tilnærminger innføre skjær via virvlingen celler i Fluid suspensjon med varierende hastigheter og varigheter, selv om disse tilnærmingene kan ikke tillate en svært presis bestemmelse av skjær stress generert. Rotasjons viskosimetre måler viskositet ved å påføre en spesifikk skjærkraft på væsker. Heri beskriver vi en anvendt metode for å bestemme effekten av bestemte laminær skjær priser på celler eller celle fragmenter i løsningen.

En av de mest uttrykte proteiner på blodplate overflaten er glykoprotein (GP) IB-IX-komplekset. GPIb-IX er primær reseptoren for plasma proteinet von Willebrand Factor (VWF). Sammen har dette reseptor-ligand paret lenge vært anerkjent som grunnlaget for plate responsen for å skjære stress¹³. I tilfelle vaskulær skade, VWF binder seg til eksponert kollagen i sub-endothelial matrise¹⁴, og dermed rekruttere blodplater til skadestedet via VWF-GPIB-IX interaksjon. VWF engasjement til sitt bindende område i GPIbα-delenhet hvis GPIb-IX under fysiologisk skjærbelastning induserer utfoldelsen av en membran-proksimale mechanosensory domene (MSD) som i sin tur aktiverer GPIb-IX¹⁵. I en fersk studie har vi vist at antistoffer mot GPIbα, som de som genereres i mange immun trombocytopeni (ITP) pasienter, er også i stand til å indusere blodplater signalering via MSD utfolder seg under skjær stress¹¹. Men i motsetning til VWF, som letter skjær indusert GPIb-IX-aktivering ved å immobilizing komplekset under normal sirkulasjon, er de bivalent Antistoffene i stand til å krysskobling blodplater via GPIb-IX og utfolde MSD i omløp. På denne måte, en mechanoreceptor hvilke er normalt aktivert av overflate immobilisering under klipping kan aktivert inne løsning. I denne rapporten, vil vi demonstrere hvordan en kapillærviskosimeteret-basert uniform skjær analysen ble utnyttes til å oppdage virkningene av bestemte nivåer av skjær stress på reseptor aktivering i løsningen.

Protocol

Alle metoder benytter donor-avledet Human blodplater beskrevet her over var godkjent av det institusjonell anmelde råd av Emory universitet/barn ‘ Healthcare av Atlanta. 1. blodprøve og blodplate isolasjon Tegn menneskelig blod fra samtykkende friske voksne donorer via venepunksjon på dagen av eksperimentet i 3,8% Trisodium Citrate. En 4,5 mL tube blod er tilstrekkelig til å gi nok blodplater rik plasma (PRP) for 20-25 tilstander i donorer som har blodplater teller nær 250 x 10<…

Representative Results

Figur 1 skisserer hvordan utløse modell av GPIB-IX aktivering, først introdusert for å forklare skjær avhengig reseptor aktivering når forankret til fartøyet veggen, kan også støtte aktivering av blodplater krysskoblet av en multivalent ligand. Figur 2 viser readouts av humant blodplate behandlet av to antistoffer rettet mot N-Terminal domenet til GPIB-IX (6B4 og 11A8), og ett kontroll antistoff (normal IgG) under skåret og statiske forhold. I <strong c…

Discussion

Protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet gir rask og allsidig vurdering av effekten av laminær skjær på blodplater og celleoverflaten reseptorer. Den spesifikke representative resultatene som presenteres her understreker hvordan virkningene av multimeric eller bivalent ligander kan påvirkes av skjær flyt. I tillegg til dette programmet, en enhetlig skjær analysen har brede anvendelser i observere skjær-avhengige effekter. I fravær av en kjent ligand-reseptor par, en enhetlig skjær analysen kan også opp…

Materials

APC anti-human CD62P (P-Selectin)	BioLegend	304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer	Brookfield	–
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL)	Vector Labs	FL-1141
Pooled Normal Human Plasma	Precision Biologic	CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate)	BD	369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle	BD	367287