En enhetlig Skjuvanalys för humant trombocyt-och cell yta receptorer via Cone-plattan Viscometry
Summary
Vi beskriver en in-Solution metod för att tillämpa enhetlig skjuvning till trombocyt yta receptorer med hjälp av kon-plattan viscometry. Denna metod kan också användas i större utsträckning för att tillämpa skjuvning på andra cell typer och cellfragment och behöver inte rikta ett specifikt ligand-receptorpar.
Abstract
Många biologiska celler/vävnader känner de mekaniska egenskaperna hos sina lokala miljöer via mechanoreceptorer, proteiner som kan reagera på krafter som tryck eller mekaniska störningar. Mechanoreceptors upptäcka deras stimuli och överföra signaler via en stor mångfald av mekanismer. Några av de vanligaste rollerna för mekanoreceptorer är i neuronala svar, som beröring och smärta, eller hår celler som fungerar i balans och hörsel. Mechanosensation är också viktigt för cell typer som regelbundet utsätts för skjuvning stress såsom endotelceller, som linje blod kärl, eller blod kroppar som upplever skjuvning i normal cirkulation. Viscometers är anordningar som detekterar vätskans viskositet. Roterande Viskosimetrar kan också användas för att tillämpa en känd skjuvkraft till vätskor. Förmågan hos dessa instrument för att införa enhetlig skjuvning till vätskor har utnyttjats för att studera många biologiska vätskor inklusive blod och plasma. Viscometry kan också användas för att applicera skjuvning på cellerna i en lösning, och för att testa effekterna av skjuvning på specifika ligand-receptorpar. Här använder vi Cone-Plate rotationsviskosimetri för att testa effekterna av endogena nivåer av skjuvspänning på trombocyter som behandlats med anti kroppar mot trombocyt mechanosensorisk receptor komplex gpib-IX.
Introduction
Mechanoreceptors är proteiner som reagerar på mekaniska stimuli, såsom tryck eller mekanisk perturbation/deformation. För vissa mechanoreceptorer är avkänning av dessa mekaniska störningar explicit för funktionen hos de cell typer i vilka de uttrycks. Ta, till exempel, stretch receptorer i baroreceptor nerv celler; dessa mekanokänsliga Jon kanaler reglerar blod trycket genom att känna vaskulär “stretch”1,2. I innerörat, Jon kanaler på hår celler upptäcka mekaniska deformationer som orsakas av ljud vågor3, och kutan låg tröskel mekanoreceptorer (ltmrs) under lätta överföring av taktil information4. I andra fall, mekanoreceptorer ger viktig information till cellen för etablering av adhesion eller tillväxt. Celler kan känna stelheten i sin lokala miljö, och kan förlita sig på kontraktila krafter via aktin cytoskelettet och integriner att diktera tillväxt eller sprida5,6.
Vid studier av receptor-ligand interaktioner i cell-eller vävnadsbaserade modeller, vanliga analyser finns som snabbt och korrekt kan rapportera effekterna av att ändra temperatur, pH, ligand koncentration, tonicitet, membran potential, och många andra parametrar kan variera in vivo. Emellertid, dessa samma analyser kan falla kort när det gäller att upptäcka bidraget av mekanisk kraft till receptor aktivering. Oavsett om cellerna känner av sin mikromiljö, upptäcker ljud vågor, eller svarar på stretch, en sak de ovan nämnda mekanoreceptorer har gemensamt är att de deltar i interaktioner där ligand, receptor, eller båda, är förankrade i en Ytan. Assays utvecklats för att testa effekterna av mekaniska krafter på receptor interaktioner återspeglar ofta detta paradigm. Mikrofluidik och flödes kammare används för att studera effekterna av skjuvflöde på celler och receptorer7,8. Dessa typer av experiment har fördelen av att tillåta fin justering av skjuvhastigheter via fastställda flödes hastigheter. Andra tekniker använder fluorescerande molekyl ära prober för att detektera krafter som används av celler på ligand-rika ytor, vilket ger en noggrann avläsning av omfattningen och rikt linjerna för de krafter som deltar i interaktionen9,10.
Förutom mechanosensation inträffar där en eller båda parter är förankrade till en yta, skjuvning stress kan påverka proteiner och celler i lösningen. Detta observeras ofta i blod kroppar/proteiner som ständigt cirkulerar, och kan manifesteras via aktivering av mechanoreceptorer som normalt är ytförankrade11, eller genom exponering av målsekvenser som skulle vara ockluderade under statiska förhållanden12. Emellertid, relativt färre tekniker assay effekterna av skjuvning kraft på partiklar i lösningen. Vissa i-lösning metoder införa skjuvning via vortexa celler i vätska fjädring med varierande hastigheter och varaktigheter, även om dessa metoder kanske inte tillåter en mycket exakt bestämning av skjuvning stress genereras. Roterande Viskosimetrar mäta viskositet genom att tillämpa en specifik skjuvning kraft till vätskor. Häri beskriver vi en tillämpad metod för att bestämma effekten av specifika laminära skjuvhastigheter på celler eller cellfragment i lösning.
Ett av de mest uttryckta proteinerna på trombocyt ytan är glykoprotein (GP) IB-IX-komplexet. GPIb-IX är den primära receptorn för plasma proteinet von Willebrand Factor (VWF). Tillsammans, detta receptor-ligand par har länge erkänts som grunden för trombocyt svar på skjuvning stress13. I händelse av vaskulära skador, VWF binder till exponerade kollagen i sub-endotelial matris14, alltså rekrytera trombocyter till platsen för skadan via VWF-GPIb-IX interaktion. VWF Engagement till sin bindnings plats i GPIbα-subenheten om GPIb-IX under fysiologisk skjuvning stress inducerar utfällning av en membran-proximal mechanosensorisk domän (MSD) som i sin tur aktiverar GPIb-IX15. I en färsk studie, har vi visat att anti kroppar mot GPIbα, som de som genereras i många immun trombocytopeni (ITP) patienter, är också kapabla att inducera trombocyt signalering via MSD veckning under skjuvning stress11. Men till skillnad från VWF, som underlättar skjuvinducerad GPIb-IX-aktivering genom att immobilisera komplexet under normal cirkulation, kan de bivalenta anti kropparna korslänka trombocyter via GPIb-IX och fälla ut MSD i omlopp. På detta sätt, en Mekanoreceptorfysiologi som normalt aktive ras av ytan immobilisering under skjuvning kan aktive ras i lösningen. I den här rapporten kommer vi att visa hur en viscometer-baserade enhetliga skjuvanalys var lånefinansierade att upptäcka effekterna av specifika nivåer av skjuvning stress på receptor aktivering i lösningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs i detta manuskript möjliggör en snabb och mångsidig bedömning av effekten av laminär skjuvning på blodplättar och cell ytan receptorer. De specifika representativa resultat som presenteras här understryker hur effekterna av multimeric eller bivalenta ligander kan påverkas av skjuvflöde. Utöver denna applikation har en enhetlig skjuvanalys breda tillämpningar för att observera skjuvberoende effekter. I avsaknad av en känd ligand-receptor par, en enhetlig skjuvning analys kan också u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbete som är relevant för denna studie stöddes delvis av nationella institut för hälsa (NIH) nationella hjärta, lung, och Blood Institute beviljar HL082808, HL123984 (R.L.), och F31HL134241 (M.E.Q.). Finansiering som också tillhandahålls av NIH National Institute of General Medicine Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); och pilot bevilja medel från Children ‘ s Healthcare i Atlanta och Emory University pediatrisk Flow Cytometry core. Författarna vill tacka Dr hans Deckmyn för att dela 6B4 anti kropp, och Emory Children ‘ s pediatrisk Research Center Flow Cytometri Core för teknisk support.
Materials
| APC anti-human CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ Viscometer | Brookfield | – | |
| FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Pooled Normal Human Plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) | BD | 369714 | |
| Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle | BD | 367287 |
Referências
- Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).
- Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
- Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).
- Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).
- Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).
- Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
- Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
- Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131 (7), 787-796 (2018).
- Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).
- Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
- Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).
- Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
- Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).
- Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. . Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , (2010).
- Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).
- Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).
- Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).
- Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).
