فصل البشرة الجرذ والأدمة مع Thermolysin للكشف عن موقع محدد الحمض النووي الريبي الالتهابي والبروتين
Summary
هنا هو بروتوكول لفصل البشرة من الأدمة لتقييم إنتاج الوسيط الالتهابي. بعد الالتهاب ، يتم فصل البشرة مخلب الجرذ الخلفي من الأدمة عن طريق الدلس الحراري عند 4 درجة مئوية. ثم يتم استخدام البشرة لتحليل الحمض النووي الريبي عن طريق RT-PCR وتقييم البروتين عن طريق وصمة عار الغربية والكيمياء المناعية.
Abstract
هناك حاجة إلى تقنيات سهلة الاستخدام وغير مكلفة لتحديد إنتاج محدد الموقع من الوسطاء الالتهابية والأعصاب أثناء إصابة الجلد والالتهاب و / أو التوعية. الهدف من هذه الدراسة هو وصف بروتوكول فصل البشرة الجلدية باستخدام الهريسين الحراري ، وهو بروتين ينشط عند 4 درجات مئوية. لتوضيح هذا الإجراء ، يتم تخدير فئران سبراغ دولي ، ويتم حقن الكفوف الخلفية اليمنى بالكاراجينان. بعد ست واثنتي عشرة ساعة من الحقن ، يتم قتل الفئران ذات الالتهاب والجرذان الساذجة ، ويتم وضع قطعة من مخلب هندى ، جلد جلابروس في متوسط النسر المعدل في Dulbecco البارد. ثم يتم فصل البشرة في غشاء الطابق السفلي من الأدمة عن طريق الليسين الحراري في برنامج تلفزيوني مع كلوريد الكالسيوم. بعد ذلك ، يتم تأمين الأدمة عن طريق ملقط التشظي الدقيق ، ويتم مضايق البشرة بلطف. تلطيخ الأزرق Toluidine من أقسام الأنسجة تبين أن البشرة يتم فصلها بشكل نظيف من الأدمة في غشاء الطابق السفلي. جميع طبقات خلايا الكيراتينية لا تزال سليمة، ويلاحظ بوضوح التلال rete البشرة جنبا إلى جنب مع المسافات البادئة من الحليمات الجلدية. يستخدم نوعي وفي الوقت الحقيقي RT-PCR لتحديد عامل نمو الأعصاب ومستويات التعبير interleukin-6. يتم إجراء النشاف الغربي والكيمياء المناعية أخيرا للكشف عن كميات من عامل نمو الأعصاب. يوضح هذا التقرير أن هضم الهضم الحراري البارد هو طريقة فعالة لفصل البشرة عن الأدمة لتقييم الحمض النووي الريبي وتعديلات البروتين أثناء الالتهاب.
Introduction
تقييم الوسطاء الالتهابية والعوامل العصبية من الجلد يمكن أن تكون محدودة بسبب عدم التجانس من أنواع الخلايا الموجودة في الأدمة الملتهبة والبشرة1،2،3. وقد استعرضت مؤخرا العديد من الإنزيمات والكيميائية والحرارية ، أو التقنيات الميكانيكية التي تنطوي على فصل طبقتين أو لأداء تفكك الخلايا للتقييم4. حمض, القلويات, الملح محايد, والحرارة يمكن تقسيم البشرة من الأدمة بسرعة, ولكن تورم الخلوية وخارج الخلية غالبا ما يحدث5,6. تريبسين, البنكرياس, الاستاز, keratinase, كولاجيناز, بروناز, ديسباس, وثيرمليسين هي الانزيمات التي استخدمت لفصل البشرة الجلدية4,7. التريبسين والإنزيمات البروتيوليكية واسعة النطاق الأخرى نشطة في 37-40 درجة مئوية ولكن يجب مراقبتها بعناية لمنع تفكك طبقات البشرة. Dispase يشق البشرة في densa lamina، ولكن يتطلب 24 ساعة لفصل في الباردة4،8 أو أقصر timepoints في 37 °C4،9. ومن السمات التي تحد من كل هذه التقنيات هو الاضطراب المحتمل لمورفولوجيا الأنسجة وفقدان سلامة الحمض النووي الريبي والبروتين.
للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي والبروتين، ينبغي أن يتم إجراء طريقة فصل الجلد في البرد لفترة قصيرة من الزمن. في تقييم تقنيات فصل الجلد لدراسات الالتهاب ، يعد الهسين الحراري إنزيما فعالا لفصل البشرة عن الأدمة في درجات الحرارة الباردة4. Thermolysin نشطة في 4 درجة مئوية، يشق البشرة hemidesmosomes من لامينا لوسيدا، ويفصل البشرة من الأدمة في غضون 1-3 ح4،8،10. الهدف من هذا التقرير هو تحسين استخدام الثيرمولين لفصل البشرة الفئران الملتهبة من الأدمة للكشف عن الحمض النووي الريبي ومستويات البروتين للوسطاء الالتهابية والعوامل العصبية. تم تقديم العديد من التقارير الأولية11،12،13،14،15. الهدف من هذه المخطوطة هو وصف تقنية فصل الجلد الأمثل باستخدام اللدائن الحرارية وإظهار الكشف عن 1) علامات الالتهاب، 2) إنترلوكين-6 (IL-6) مرنا، و 3) عامل نمو الأعصاب (NGF) مرنا والبروتين في البشرة من الفئران مع التهاب الناجم عن الكاراجينان (C-II)16،17. تقرير أولي باستخدام نموذج المساعد فروند الكامل يشير إلى أن NGF مرنا ومستويات البروتين زيادة في وقت مبكر خلال التهاب15. في الفئران، والحساسية الجلد مع التطبيق الموضعي لأوكسيازولون يسبب ارتفاع مبكر في IL-6 مرنا باستخدام التهجين في الموقع36. وقد تورط كل من IL-6 وNGF في C-II18,19, ولكن لم تكن هناك تقارير تصف الحمض النووي الريبي أو مستويات البروتين لIL-6 أو NGF على وجه التحديد من البشرة خلال المراحل الحادة من C-II.
تقنية الهسين الحراري غير مكلفة ومباشرة لأداء. وعلاوة على ذلك، فصل الحرارة من البشرة من الأدمة يسمح لرنا، لطخة الغربية، والتحليل المناعي الكيميائي للوسطاء الالتهابات والعوامل العصبية خلال عملية الالتهاب15. يجب أن يكون المحققون قادرين على استخدام هذه التقنية بسهولة في كل من الدراسات قبل السريرية والسريرية لالتهاب الجلد.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقررت الدراسة أن البشرة من جلد مخلب الجرذ الخلفي glabrous تم فصلها بسهولة من الأدمة باستخدام الليسين الحراري (0.5 mG/mL) في PBS مع كلوريد الكالسيوم 1 mM في 4 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. وأشار التقييم النسيجي إلى أن البشرة انفصلت عن الأدمة في غشاء الطابق السفلي وأن التلال الشبكية البشرة سليمة. Thermolysin هو metallo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل لهذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة NIH-AR047410 (KEM)
Materials
| λ-carrageenan | Millipore Sigma | 22049 | Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107 | For RT-PCR analysis |
| Calcium chloride (CaCl2), anhydrous | Millipore Sigma | 499609 | Prevents autolysis of thermolysin |
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Millipore Sigma | C0612 | Aqueous mounting medium after toluidine blue staining |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunohistochemistry |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11966-025 | To maintain tissue integrity |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Millipore Sigma | E6758 | Stops thermolysin reaction |
| Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase | Promega | M1701 | For complementary DNA synthesis |
| Mouse anti-NGF Antibody (E-12) | Santa Cruz Biotechnology | sc-365944 | For neurotrophin immunohistochemistry |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | To retard immunofluorescence quenching |
| Rabbit anti-PGP 9.5 | Cedarlane Labs | CL7756AP | For intraepidermal nerve staining |
| SAS Sprague Dawley Rat | Charles River | Strain Code 400 | Animal used for inflammation studies |
| Shandon M-1 Embedding Matrix | Thermo Fisher Scientific | 1310TS | Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | For RT-PCR analysis |
| SYBR Select Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4472908 | For RT-PCR analysis |
| Thermolysin | Millipore Sigma | T7902 | From Geobacillus stearothermophilus |
| Toluidine Blue | Millipore Sigma | 89640 | For tinctorial staining for brightfield microscopy |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | For total RNA extraction for RTPCR |
Referências
- Choi, J. E., Di Nardo, A. Skin neurogenic inflammation. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).
- Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. The role of neurotrophins in inflammation and allergy. Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).
- Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. Pathogenesis of psoriasis. Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).
- Zou, Y., Maibach, H. I. Dermal-epidermal separation methods: research implications. Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).
- Baumberger, J. Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis. Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).
- Felsher, Z. Studies on the adherence of the epidermis to the corium. Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).
- Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes. Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).
- Rakhorst, H. A., et al. Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase. International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).
- Tschachler, E., et al. Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis. Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).
- Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation. Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).
- Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization. Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).
- Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents. Society for Neuroscience Abstract. , 584 (2010).
- Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. Structure-property relationship of skin. Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , (2011).
- Anderson, M. B., Miller, K. E. Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Gujar, V. K. E., Miller, K. E. Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study. Society for Neuroscience Abstract. 220, 23 (2017).
- Vinegar, R., et al. to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat. Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).
- Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund’s Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , (2012).
- Li, K. K., et al. exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema. International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).
- Sammons, M. J., et al. Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway. Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).
- Hoffman, E. M., Miller, K. E. Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat. Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision. Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023 (2015).
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).
- Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation. Biomolecules. 6 (1), 10 (2016).
- van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. Handbook of Proteolytic Enzymes. , 540-553 (2013).
- Matthews, B. W. Thermolysin. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry. , (2011).
- Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).
- Glade, C. P., et al. Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol. Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).
- Sato, J. D., Kan, M. Media for culture of mammalian cells. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation. Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).
- Germain, L., et al. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Michel, M., et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).
- Fassina, G., et al. Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex. European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).
- Petho, G., Reeh, P. W. Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors. Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).
- Djouhri, L., et al. Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons. Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).
- Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. Nerve growth factor and pain mechanisms. Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).
- Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization. Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).
- Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts. MOJ Toxicology. 1 (1), 00005 (2015).
