Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs
Summary
Wir zeigen eine Methode zur Nekropsie und Zerlegung von Prostatakrebsmodellen der Maus, die sich auf die Prostatatumorsektion konzentriert. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Erzeugung von Maus-Prostatatumor-Organoiden wird ebenfalls vorgestellt.
Abstract
Methoden, die auf homologe Rekombination basieren, um Gene zu modifizieren, haben die biologische Forschung erheblich gefördert. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind eine strenge Methode zur Untersuchung der Entwicklung und Krankheit von Säugetieren. Unser Labor hat mehrere GEMMs von Prostatakrebs (PCa) entwickelt, die keine Expression eines oder mehrerer Tumorsuppressorgene mit dem standortspezifischen Cre-loxP-Rekombinatosasesystem und einem Prostata-spezifischen Promotor haben. In diesem Artikel beschreiben wir unsere Methode zur Nekropsie dieser PCa GEMMs, die sich in erster Linie auf die Zerlegung von Prostatatumoren der Maus konzentriert. Neue Methoden, die in den letzten zehn Jahren entwickelt wurden, haben die Kultur epitheliaaler Zellen erleichtert, Organsysteme in vitro in drei Dimensionen zu modellieren. Wir beschreiben auch eine 3D-Zellkultur-Methode, um Tumor-Organoide aus Maus-PCa GEMMs zu generieren. Die präklinische Krebsforschung wurde von 2D-Zellkultur und zelllinienabgeleiteten oder vom Patienten abgeleiteten Xenograft-Modellen dominiert. Diese Methoden fehlen Tumor-Mikroumgebung, eine Einschränkung der Verwendung dieser Techniken in präklinischen Studien. GEMMs sind physiologisch relevanter für das Verständnis von Tumorgenese und Krebsprogression. Tumororganoidkultur ist ein In-vitro-Modellsystem, das Tumorarchitektur und Zelllinieneigenschaften rekapituliert. Darüber hinaus ermöglichen 3D-Zellkulturmethoden das Wachstum normaler Zellen zum Vergleich mit Tumorzellkulturen, die mit 2D-Zellkulturtechniken nur selten möglich sind. In Kombination hat die Verwendung von GEMMs und 3D-Zellkultur in präklinischen Studien das Potenzial, unser Verständnis der Krebsbiologie zu verbessern.
Introduction
Seit den späten 1980er Jahren hat die Fähigkeit, Gene durch homologe Rekombination zu verändern, die Untersuchung biologischer Systeme stark vorangebracht1. Induzible, gewebe- oder zellspezifische promotorische Systeme und standortspezifische Rekombinatore wie Cre-loxP haben fortgeschrittene genetische Studien, indem sie die Kontrolle über genetische Veränderungen sowohl zeitlich als auch räumlich erleichtern2,3, 4. Die Kombination dieser genetischen Strategien hat eine breite Palette von experimentellen Modellsystemen5,6,7geschaffen.
Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind ein integrales Werkzeug, um zu beurteilen, wie einzelne Gene oder Gengruppen die Entwicklung und Krankheit von Säugetieren beeinflussen. In der präklinischen Krebsforschung sind GEMMs die physiologisch relevanteste und strengste Methode zur Untersuchung der Krebsentwicklung, Progression und Behandlung8. Unser Labor ist spezialisiert auf die Erzeugung und Charakterisierung von Krebs-GEMMs.
Der am häufigsten diagnostizierte nicht-kutane Krebs bei Männern in den Vereinigten Staaten ist Prostatakrebs (PCa). Die Mehrheit der Patienten mit PCa haben eine Erkrankung mit geringem Risiko und eine hohe Überlebenswahrscheinlichkeit, aber die Überlebensraten sinken drastisch, wenn die Krankheit im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert wird oder wenn eine gezielte Hormontherapie das Fortschreiten zu einer aggressiven, nicht heilbaren PCa induziert. Subtypen9,10. Unser Labor hat GEMMs entwickelt, die Flockenallele eines oder mehrerer Tumorsuppressorgene verwenden. Rekombination und Verlust der Tumorsuppressor-Genexpression tritt speziell in der Prostata auf, da wir ein Transgen mit Cre-Rekombinantase flussabwärts des Probasinpromotors eingeführt haben, der nur in den Prostataepithelzellen aktiviert ist11, 12. Wir haben auch unsere GEMMs gezüchtet, um ein Cre-Reporter-Transgen namens mT/mG zu enthalten, das eine tomatenfluoreszierende Proteinexpression in Zellen ohne Cre- und grüne fluoreszierende Protein-Expression (GFP) in Zellen mit Cre13induziert. Während die Präsentation dieser Methode und unsere repräsentativen Ergebnisse GEMMs zeigen, die wir in unserem Labor untersuchen, kann dieses Protokoll verwendet werden, um Prostatakrebs-Organoide aus jedem Mausmodell zu erzeugen. Jedoch, wie im Detail in unserem repräsentativen Ergebnisabschnitt diskutiert, haben wir beobachtet, dass bestimmte Tumoreigenschaften für die Erzeugung von Prostatakrebs-Organoid optimal sind.
In den letzten zehn Jahren haben neue Methoden zur Kultivierung von Zellen aus Geweben epithelialen Ursprungs zu signifikanten Fortschritten in unserer Fähigkeit geführt, Organsysteme in vitro14,15zu modellieren. Der Begriff “3D-Zellkultur” wurde den Techniken bei der Herstellung und Aufrechterhaltung von Organoiden zugeschrieben, die im Allgemeinen als Strukturen definiert werden können, die aus Zellen bestehen, die sekundäre Architektur zusammenfügen, die durch organspezifische Zelllinien angetrieben wird. Merkmale16. Diese neuen Methoden unterscheiden sich von der klassischen 2D-Zellkultur dadurch, dass Zellen keine Transformation oder Verewigung für langfristiges Wachstum erfordern; So können 3D-Kulturen normaler Zellen mit erkrankten Zellen verglichen werden. Dies ist besonders wertvoll in der Krebsforschung, wo normale Zellkontrollkulturen in der Regel nicht verfügbar waren. Darüber hinaus bilden Organoide spontan sekundäre Gewebearchitekturen mit entsprechend differenzierten Zelltypen, was sie zu einem besseren Modellsystem macht, um Krebs in vitro zu verstehen als 2D-Zelllinien17. Unser Labor hat 3D-Organoidlinien aus Tumorproblem erstellt, die aus unseren PCa GEMMs isoliert wurden, um unsere In-vivo-Daten zu ergänzen und Experimente durchzuführen, die bei GEMMs nicht möglich wären.
In diesem Artikel stellen wir schriftliche und visuelle Protokolle für die komplette Nekropsie von PCa GEMMs vor, einschließlich der Zerlegung von verschiedenen Mausprostatalappen und metastasierenden Läsionen. Wir beschreiben und zeigen eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Erzeugung von Organoiden aus Maus-Prostatatumoren auf der Grundlage eines Protokolls, das zuvor von Drost et al. veröffentlicht wurde, um Organoide aus normalem Maus-Prostatagewebe abzuleiten18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls zur Prostatatumorsektion und Organoiderzeugung
Die Entfernung von Nicht-Prostatagewebe und die feine Zerlegung des Prostatatumors der Maus ist entscheidend für die optimale Erzeugung von Krebsorganoiden, da sowohl Nicht-Prostata-Epithelzellen als auch normale Prostata-Epithelzellen Organoide erzeugen. Für solide Prostata-Tumoren speziell, Es ist wichtig, Bereiche des lebensfähigen Tumors zu isolieren, um Kontamination mit nekrotischem Gewebe zu entfernen,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem Calvin Kuo Laboratory an der Stanford University für die Bereitstellung von HEK293-Zellen, die entweder mit HA-Maus Noggin-Fc oder HA-Maus Rspo1-Fc stabil transfiziert wurden. Wir möchten uns auch bei Dr. Dean Tang dafür bedanken, dass er uns den Zugang zum fluoreszierenden Seziermikroskop in seinem Labor ermöglicht hat. Diese Arbeit wurde von CA179907 an D.W.G. vom National Cancer Institute unterstützt. Gemeinsame Ressourcen im Roswell Park Comprehensive Cancer Center wurden von National Institutes of Health Cancer Center Support Grant CA016056 unterstützt.
Materials
| 0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10 % neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
Referências
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