تقييم صلاحية الخلية والموت في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية

Summary

هنا، نقدم العديد من الطرق البسيطة لتقييم الجدوى والموت في كروية الخلايا السرطانية ثلاثية الأبعاد، والتي تحاكي التدرجات الفيزيائية الكيميائية للأورام الحية أفضل بكثير من الثقافة 2D. نموذج كروي, وبالتالي, يسمح تقييم فعالية المخدرات السرطان مع تحسين الترجمة إلى في ظروف الجسم الحي.

Abstract

الكرويات ثلاثية الأبعاد من الخلايا السرطانية هي أدوات هامة لكل من شاشات المخدرات السرطان واكتساب البصيرة الميكانيكية في بيولوجيا الخلايا السرطانية. قوة هذا الإعداد يكمن في قدرتهعلى تقليد العديد من جوانب الظروف في الجسم الحي من الأورام في حين يجري سريعة ورخيصة، وتنوعا بما فيه الكفاية للسماح فحص عالية الإنتاجية نسبيا. يمكن أن تلخص ظروف الثقافة الكروية التدرجات الفيزيائية الكيميائية في الورم، بما في ذلك الحموضة خارج الخلايا المتزايدة، وزيادة اللاكتات، وتقليل توافر الجلوكوز والأكسجين، من محيط كروي إلى جوهره. أيضا، يتم تقليد الخصائص الميكانيكية والتفاعلات خلية الخلية من الأورام في الجسم الحي جزئيا من قبل هذا النموذج. خصائص محددة، وبالتالي ظروف النمو الأمثل، من كروية 3D، تختلف على نطاق واسع بين أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية. وعلاوة على ذلك، فإن تقييم صلاحية الخلايا والموت في الكرويات ثلاثية الأبعاد يتطلب أساليب تختلف جزئياً عن تلك المستخدمة في الثقافات ثلاثية الأبعاد. هنا نحن وصف عدة بروتوكولات لإعداد كروية 3D من الخلايا السرطانية، واستخدام هذه الثقافات لتقييم قدرة الخلايا على البقاء والموت في سياق تقييم فعالية الأدوية المضادة للسرطان.

Introduction

استخدام نماذج متعددة الخلايا كروية في علم الأحياء السرطان هو عدة عقود من العمر^1,2, ولكن اكتسبت زخما كبيرا في السنوات الأخيرة. وهذا يعكس إلى حد كبير زيادة الوعي بمدى قوة النمط الظاهري للخلايا السرطانية يعتمد على بيئتها الدقيقة وظروف نموها المحددة. البيئة الدقيقة في الأورام الصلبة تختلف اختلافا جوهريا عن تلك التي في الأنسجة العادية المقابلة. ويشمل ذلك الظروف الفيزيائية الكيميائية مثل درجة الألف الألف، وتوتر الأكسجين، وكذلك الضغط الخلالي، وتدرجات تركيز العوامل القابلة للذوبان مثل المواد الغذائية، ومنتجات النفايات، ومركبات الإشارات المفرزة (عوامل النمو، السيتوكينات). وعلاوة على ذلك، فإنه يشمل تنظيم المصفوفة خارج الخلية (ECM)، والتفاعلات الخلية الخلية والإشارات بين الخلايا، وجوانب أخرى من العمارة ثلاثية الأبعاد (3D) معينة للورم^{3،4، 5,6}. الظروف البيئية الدقيقة المحددة التي توجد فيها الخلايا السرطانية، تؤثر بشكل عميق على ملامح التعبير الجيني والخصائص الوظيفية، ومن الواضح أنه، بالمقارنة مع تلك التي تنمو في الخلايا 2D، والنمط الظاهري من كروية 3D يحاكي عن كثب أن من الأورام في الجسم الحي^{7،8،9،10،11}. نماذج 2D، حتى لو كانت تستخدم نقص الأكسجة، الحموضة الحمضية، والتركيزات اللاكتات عالية لتقليد الجوانب المعروفة من البيئة الدقيقة الورم، لا تزال تفشل في التقاط تدرجات المعلمات الفيزيائية الكيميائية الناشئة داخل الأورام، فضلا عن ورمها 3D الهندسه المعماريه. من ناحية أخرى، النماذج الحيوانية مكلفة، بطيئة، وإشكالية أخلاقيا، وعموما، لديها أيضا أوجه القصور في قدرتها على تلخيص ظروف الورم البشري. وبالتالي، تم تطبيق كرويات ثلاثية الأبعاد كنموذج تعقيد متوسط في دراسات مجموعة واسعة من خصائص معظم أنواع السرطان الصلبة^{9،11،12،13، 14,15,16,17}.

استخدام المستخدمة على نطاق واسع من كروية 3D هو في فحص الاختبارات من فعالية العلاج بالسرطان^9,18,19,20. الاستجابات العلاجية حساسة بشكل خاص للورم الميكروي، مما يعكس كل من تأثير التقصير، والانتشار المقيد، والضغط الخلالي العالي، ودرجة الحموضة البيئية الحمضية على تسليم الأدوية، وتأثير نقص الأكسجة وغيرها جوانب من البيئة الدقيقة على استجابة موت الخلية^9,17. لأن البيئة داخل كروية 3D يتطور بطبيعتها كل هذه الخصائص^{7،8،9،10،11}، يمكن توظيف الثقافات خلية 3D تحسين ترجمة النتائج إلى ظروف حية بشكل كبير، مع السماح بكفاءة وبأسعار معقولة عالية الإنتاجية الفرز من صافي النمو. ومع ذلك، لا تزال الغالبية العظمى من الدراسات على استجابة المخدرات من الخلايا السرطانية تجري في ظل ظروف 2D. وهذا يعكس على الأرجح أنه، في حين أن بعض الاختبارات يمكن تنفيذها بسهولة نسبيا لثقافات الخلايا 3D، وكثير، مثل اختبارات البقاء، والنشاف الغربية، وتحليل الفلور المناعي، يتم القيام به بشكل مريح أكثر بكثير في 2D مما كانت عليه في 3D.

والهدف من العمل الحالي هو توفير الفحوصات والبروتوكولات الدقيقة سهلة الملاءمة لتحليل تأثير العلاج بالأدوية المضادة للسرطان على قدرة الخلايا السرطانية على البقاء على قيد الحياة في بيئة محاكاة للورم ثلاثي الأبعاد. وعلى وجه التحديد، نقدم ونقارن ثلاث طرق مختلفة لتشكيل كروي، تليها طرق للتحليلات النوعية والكمية للنمو، والقدرة على البقاء، والاستجابة للمخدرات.

Protocol

1. جيل من الكرويدات إعداد تعليق الخلية لتشكيل كرويملاحظة: خطوط الخلايا المختلفة لها خصائص التصاق مختلفة جداويجب أن يتم تأسيس بروتوكول تشكيل كروية مناسبة في كل حالة. لقد وجدنا أن خلايا MCF-7 و BxPC-3 مناسبة لتشكيل كرويتلقائي، في حين أن MDA-MB-231، SKBr-3، Panc-1 و MiaPaCa تتطلب إضافة غشاء الطا?…

Representative Results

اختبارات النمو كروية على أساس بروتوكول تشكيل كروية موضحة تخطيطيا في الشكل 1ألف والشكل 1B، واستخدمت كنقطة انطلاق لتحليل آثار العلاجات المضادة للسرطان المخدرات في ورم 3D محاكاة الإعداد. السهولة التي يتم تشكيل هاون الكروية هو خط الخلية محددة…

Discussion

وقد ثبت استخدام كرويرويدال الخلايا السرطانية 3D أداة قيمة وتنوعا ليس فقط لفحص المخدرات المضادة للسرطان، ولكن أيضا للحصول على البصيرة الميكانيكية في تنظيم موت الخلايا السرطانية والقدرة على البقاء في ظل ظروف تحاكي تلك الموجودة في الورم الصغرى البيئة. وهذا أمر حاسم بشكل خاص حيث تتأثر تأثيرا…

Materials

2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI)	Invitrogen	# C10595	For staining nuclei
5-Fluorouracil (5-FU)	Sigma-Aldrich	#F6627	Component in chemotherapeutic treatment
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA)	Life Technologies	#E3111	Inhibitor of NHE1
Antibody against PARP and cPARP	Cell signaling	#9542	Used in western blotting
Antibody against Ki-67	Cell signaling	#9449	Used for IHC
Antibody against p53	Cell Signaling	#2524	Used for IHC
Antibody against β-actin	Sigma	A5441	Used in western blotting
Bactoagar	BD Bioscience	#214010	Used for agarose gel preparation
Benchmark protein ladder	Invitrogen	#10747-012	Used for SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kit	Bio-Rad Laboratories	#500-0113, #500-0114, #500-0115	Used for protein determination from lysates
Bürker chamber	Marienfeld	610311	For cell counting
BX63 epifluoresence microscope	Olympus		Used for fluorescent imaging
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	#G9681	Used for the cell viability assay
Cisplatin	Sigma-Aldrich	#P4394	Component in chemotherapeutic treatment
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,  Ultra-low attachment, With lid, Sterile	Corning	#4520	Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point
Corning 96 well, clear round bottom,  Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile	Corning	#7007	Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point
Criterion TGX Precast Gels	Bio-Rad	5671025	Used for SDS-PAGE
Doxorubicin	Abcam	#120629	Component in chemotherapeutic treatment
FLUOStar Optima Microplate reader	BMG Labtech		Used for recording luminescence
Formaldehyde	VWR Chemicals	#9713.1000	Used for cell fixation
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Gibco	#A1413202	Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.
Heat-inactivated FBS	Sigma	#F9665	Serum for growth media
ImageJ	NIH		Scientific Image analysis
Medim Uni-safe casette	Medim Histotechnologie	10-0114	Used for storage of embedded spheroids
Mini protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics GmBH	# 11836153001	Used for lysis buffer preparation
MZ16 microscope	Leica		Used for light microscopic images
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer	Invitrogen	#NP0007	Used for western blotting
Pierce ECL Western blotting substrate	Thermo scientific	#32106	Used for western blotting
Ponceau S	Sigma-Aldrich	#P7170-1L	Used for protein band staining
Prism 6.0	Graphpad		Scientific graphing and statistical software
Propidium iodide (1mg/ml solution in water)	Invitrogen	P3566	Light sensitive
Sterile reservoirs, multichannel	SPL lifesciences	21002	Used for seeding cells for spheroid formation
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide	Menzel-Gläser	#J3800AMNZ	Microscope glass slide used for embedding
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	#T5648	Used as chemotherapeutic treatment
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#170-4159	Used for western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer	Bio-Rad	#161 0732	Used for SDS-PAGE
Trypsin-EDTA solution	Sigma	#T4174	Cell dissociation enzyme