Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Summary

Aqui, nós apresentamos diversos métodos simples para avaliar a viabilidade e a morte em spheroids da pilha de cancro 3D, que imitam os gradientes physico-químicos de tumores in vivo muito melhor do que a cultura 2D. O modelo esferóide, portanto, permite a avaliação da eficácia do câncer de drogas com melhor tradução para as condições in vivo.

Abstract

Os esferoides tridimensionais de pilhas de cancro são ferramentas importantes para telas da droga do cancro e para ganhar a introspecção mecanicista na biologia da pilha de cancro. O poder desta preparação encontra-se em sua habilidade de imitar muitos aspectos das condições in vivo dos tumores ao ser rápido, barato, e versátil bastante permitir a seleção relativamente high-throughput. As condições da cultura esferóide podem recapitular os gradientes físico-químicos em um tumor, incluindo a crescente acidez extracelular, o aumento do lactato e a diminuição da disponibilidade de glicose e oxigênio, da periferia esferóide ao seu núcleo. Também, as propriedades mecânicas e as interações Cell-Cell de tumores in vivo são em parte imitada por este modelo. As propriedades específicas e, consequentemente, as condições ideais de crescimento, de esferóides 3D, diferem amplamente entre diferentes tipos de células cancerosas. Além disso, a avaliação da viabilidade celular e morte em esferóides 3D requer métodos que diferem em parte daqueles empregados para culturas 2D. Aqui nós descrevemos diversos protocolos para preparar esferoides 3D de pilhas de cancro, e para usar tais culturas para avaliar a viabilidade e a morte da pilha no contexto de avaliar a eficácia de drogas anticâncer.

Introduction

O uso de modelos de esferóide multicelular na biologia do câncer é de várias décadas^1,2, mas ganhou um impulso substancial nos últimos anos. Em grande parte, isso reflete o aumento da consciência de quão fortemente o fenótipo das células cancerosas é dependente do seu microambiente e condições de crescimento específicas. O microambiente em tumores sólidos é fundamentalmente diferente do que nos tecidos normais correspondentes. Isso inclui condições físico-químicas como pH, tensão de oxigênio, bem como pressão intersticial, gradientes de concentração de fatores solúveis, como nutrientes, resíduos e compostos de sinalização secretados (fatores de crescimento, citocinas). Além disso, inclui a organização da matriz extracelular (ECM), interações célula-célula e sinalização intercelular, e outros aspectos da arquitetura tridimensional (3D) particular do tumor^{3,4, 5,6}. As condições microambientais específicas em que as células cancerosas existem, afetam profundamente seu perfil de expressão gênica e propriedades funcionais, e é claro que, em comparação com a das células cultivadas em 2D, o fenótipo de esferóides 3D muito mais estreitamente imita o dos tumores in vivo^7,8,9,10,11. os modelos 2D, mesmo se empregam a hipóxia, o pH ácido, e as concentrações elevadas do lactato para imitar aspectos conhecidos do microambiente do tumor, ainda não conseguem capturar os gradientes de parâmetros physico-químicos que levantam-se dentro dos tumores, assim como seu tumor 3D Arquitetura. Por outro lado, os modelos animais são dispendiosos, lentos e eticamente problemáticos, e geralmente, também têm deficiências na sua capacidade de recapitular as condições do tumor humano. Consequentemente, os esferóides 3D têm sido aplicados como um modelo de complexidade intermediária em estudos de uma ampla gama de propriedades da maioria dos cânceres sólidos^{9,11,12,13, 14,15,16,17}.

Um uso amplamente empregado de esferóides 3D está em ensaios de triagem da eficácia da terapia anticâncer^9,18,19,20. As respostas ao tratamento são particularmente sensíveis ao microambiente tumoral, refletindo tanto o impacto da tortuosidade, a difusão restrita, a alta pressão intersticial, quanto o pH ambiental ácido na entrega de fármacos, e o impacto da hipóxia e outros aspectos do microambiente na resposta de morte celular^9,17. Porque o ambiente dentro de esferoides 3D inerentemente desenvolve todas essas propriedades^7,8,9,10,11, empregando culturas de células 3D pode melhorar substancialmente a tradução dos resultados para as condições in vivo, mas permitir uma triagem eficiente e acessível de alta taxa de transferência do crescimento líquido. No entanto, a grande maioria dos estudos sobre a resposta medicamentosa das células cancerosas ainda são realizadas em condições 2D. Isso provavelmente reflete que, enquanto alguns ensaios podem ser relativamente facilmente implementados para culturas de células 3D, muitos, como ensaios de viabilidade, western blotting, e análise de imunofluorescência, são muito mais convenientemente feito em 2D do que em 3D.

O objetivo do presente trabalho é fornecer ensaios facilmente amáveis e protocolos precisos para análises do efeito do tratamento com medicamentos anticancerígenos sobre a viabilidade de células cancerosas e sobrevivência em um tumor 3D que imita o ajuste. Especificamente, fornecemos e comparamos três métodos diferentes para a formação de esferóides, seguidos de métodos para análises qualitativas e quantitativas de crescimento, viabilidade e resposta a medicamentos.

Protocol

1. geração de spheroids Preparando suspensões de células para formação de esferóidesNota: as linhas celulares diferentes têm propriedades de adesão muito diferentes e o protocolo de formação de esferóide mais adequado deve ser estabelecido em cada caso. Nós encontramos que as pilhas de MCF-7 e de bxpc-3 são apropriadas para a formação esferóide espontânea, quando MDA-MB-231, skbr-3, Panc-1 e miapaca exigirem a adição de membrana reconstituída do porão para dar forma co…

Representative Results

Os ensaios de crescimento esferóide com base no protocolo de formação esferóide, ilustrados esquematicamente na Figura 1A e na Figura 1B, foram utilizados como ponto de partida para análise dos efeitos de tratamentos medicamentoso anticancerígenos em um tumor 3D imitando o ajuste. A facilidade com que os esferoides são formados é a linha celular específica, e algumas linhas celulares necessitam de suplementação com RB…

Discussion

O uso de esferoides da pilha do cancro 3D provou uma ferramenta valiosa e versátil não somente para a seleção anticâncer da droga, mas igualmente para ganhar a introspecção mecanicista na regulação da morte e da viabilidade da pilha de cancro as circunstâncias que imitam aquelas no tumor microambiente. Isto é particularmente crucial porque a acessibilidade, a captação celular, e os efeitos intracelular de drogas quimioterapêuticas são impactados profundamente pelas condições físico-químicas no tumor, i…

Materials

2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI)	Invitrogen	# C10595	For staining nuclei
5-Fluorouracil (5-FU)	Sigma-Aldrich	#F6627	Component in chemotherapeutic treatment
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA)	Life Technologies	#E3111	Inhibitor of NHE1
Antibody against PARP and cPARP	Cell signaling	#9542	Used in western blotting
Antibody against Ki-67	Cell signaling	#9449	Used for IHC
Antibody against p53	Cell Signaling	#2524	Used for IHC
Antibody against β-actin	Sigma	A5441	Used in western blotting
Bactoagar	BD Bioscience	#214010	Used for agarose gel preparation
Benchmark protein ladder	Invitrogen	#10747-012	Used for SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kit	Bio-Rad Laboratories	#500-0113, #500-0114, #500-0115	Used for protein determination from lysates
Bürker chamber	Marienfeld	610311	For cell counting
BX63 epifluoresence microscope	Olympus		Used for fluorescent imaging
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	#G9681	Used for the cell viability assay
Cisplatin	Sigma-Aldrich	#P4394	Component in chemotherapeutic treatment
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,  Ultra-low attachment, With lid, Sterile	Corning	#4520	Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point
Corning 96 well, clear round bottom,  Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile	Corning	#7007	Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point
Criterion TGX Precast Gels	Bio-Rad	5671025	Used for SDS-PAGE
Doxorubicin	Abcam	#120629	Component in chemotherapeutic treatment
FLUOStar Optima Microplate reader	BMG Labtech		Used for recording luminescence
Formaldehyde	VWR Chemicals	#9713.1000	Used for cell fixation
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Gibco	#A1413202	Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.
Heat-inactivated FBS	Sigma	#F9665	Serum for growth media
ImageJ	NIH		Scientific Image analysis
Medim Uni-safe casette	Medim Histotechnologie	10-0114	Used for storage of embedded spheroids
Mini protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics GmBH	# 11836153001	Used for lysis buffer preparation
MZ16 microscope	Leica		Used for light microscopic images
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer	Invitrogen	#NP0007	Used for western blotting
Pierce ECL Western blotting substrate	Thermo scientific	#32106	Used for western blotting
Ponceau S	Sigma-Aldrich	#P7170-1L	Used for protein band staining
Prism 6.0	Graphpad		Scientific graphing and statistical software
Propidium iodide (1mg/ml solution in water)	Invitrogen	P3566	Light sensitive
Sterile reservoirs, multichannel	SPL lifesciences	21002	Used for seeding cells for spheroid formation
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide	Menzel-Gläser	#J3800AMNZ	Microscope glass slide used for embedding
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	#T5648	Used as chemotherapeutic treatment
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes	Bio-Rad	#170-4159	Used for western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer	Bio-Rad	#161 0732	Used for SDS-PAGE
Trypsin-EDTA solution	Sigma	#T4174	Cell dissociation enzyme