Analys av interaktioner mellan Endobiotika och Human Gut Microbiota med in vitro-system för bad jäsning
Summary
Beskrivs här är ett protokoll för att undersöka samspelet mellan endobiotika och Human Gut bakterieflora med in vitro-sats fermenterings system.
Abstract
Mänskliga intestinala mikroorganismer har nyligen blivit ett viktigt mål för forskning för att främja människors hälsa och förebygga sjukdomar. Följaktligen har undersökningar av interaktioner mellan endobiotika (t. ex. läkemedel och prebiotika) och tarmbiota blivit ett viktigt forskningsämne. Emellertid, in vivo experiment med frivilliga försökspersoner är inte idealiska för sådana studier på grund av bioetik och ekonomiska begränsningar. Som ett resultat, djurmodeller har använts för att utvärdera dessa interaktioner in vivo. Ändå, djurmodell studier är fortfarande begränsad av bioetiska överväganden, förutom olika kompositioner och mångfaldigheter av bakterieflora hos djur vs. människor. En alternativ forskningsstrategi är användningen av batch jäsning experiment som möjliggör utvärdering av samspelet mellan endobiotika och Gut bakterieflora in vitro-. För att utvärdera denna strategi, bifidobakteriell (BIF) exopolysackarider (EPS) användes som en representativ xenobiotic. Sedan, samspelet mellan BIF EPS och Human Gut bakterieflora undersöktes med hjälp av flera metoder såsom tunnskiktskromatografi (TLC), bakteriell gemenskap sammansättning analys med 16s rRNA gen hög kapacitet sekvensering, och gaskromatografi av kortkedjiga fettsyror (SCFAs). Presenteras här är ett protokoll för att undersöka samspelet mellan endobiotika och Human Gut bakterieflora med in vitro-sats fermenterings system. Viktigt, detta protokoll kan också ändras för att undersöka allmänna interaktioner mellan andra endobiotika och Gut bakterieflora.
Introduction
Gut bakterieflora spela en viktig roll i hur mänskliga tarmarna och i Host Health. Därför har Gut bakterieflora nyligen blivit ett viktigt mål för sjukdomsförebyggande och terapi1. Dessutom, Gut bakterier interagerar med värd tarmceller och reglera grundläggande värdprocesser, inklusive metaboliska aktiviteter, näringsämnes tillgänglighet, immunsystemet modulering, och även hjärnans funktion och beslutsfattande2,3 . Endobiotika har stor potential att påverka bakterie sammansättningen och mångfalden av tarmfloran. Sålunda, interaktioner mellan endobiotika och Human Gut bakterieflora har väckt ökad forskning uppmärksamhet4,5,6,7,8,9.
Det är svårt att utvärdera interaktioner mellan endobiotika och Human Gut bakterieflora in vivo på grund av bioetik och ekonomiska begränsningar. Till exempel kan experiment som undersöker samspelet mellan endobiotika och Human Gut bakterieflora inte utföras utan tillstånd från Food and Drug Administration, och rekrytering av volontärer är dyrt. Därför används ofta djurmodeller för sådana utredningar. Emellertid, användningen av djurmodeller är begränsad på grund av olika bakterieflora kompositioner och mångfald i djur-vs. Human-associerade samhällen. En alternativ in vitro-metod för att utforska samspelet mellan endobiotika och Human Gut bakterieflora är genom användning av batch kultur experiment.
Exopolysackarider (EPSs) är prebiotika som avsevärt bidrar till upprätthållandet av människors hälsa10. Distinkta EPSs som består av olika monosackarid kompositioner och strukturer kan uppvisa distinkta funktioner. Tidigare analyser har fastställt sammansättningen av BIF EPSS, som är den representativa xenobiotiska riktad i den aktuella studien11. Emellertid, värd-associerade metaboliska effekter har inte beaktats när det gäller EPS sammansättning och mångfald.
Det protokoll som beskrivs här använder fekal bakterieflora från 12 frivilliga att jäsa BIF EPSS. Tunnskiktskromatografi (TLC), 16S rRNA gen hög kapacitet sekvensering, och gaskromatografi (GC) används sedan i kombination för att undersöka samspelet mellan EPSs och Human Gut Microbiota. Distinkta fördelar med detta protokoll jämfört med in vivo experiment är dess låga kostnader och undvikande av störande effekter från värdens metabolism. Dessutom kan det beskrivna protokollet användas i andra studier som undersöker interaktioner mellan endobiotika och Human Gut Microbiota.
Protocol
Representative Results
Discussion
Betydande framsteg har gjorts mot förståelsen av människans tarmbiota-sammansättning och aktiviteter under det senaste decenniet. Som en konsekvens av dessa studier, holobiont konceptet har dykt upp, som representerar samspelet mellan värdar och associerade mikrobiella samhällen, såsom mellan människor och deras Gut bakterieflora19,20. Dessutom är människor även nu betraktas som superorganismer21, vari bakterieflora har erkänts…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie finansierades av National Nature Science Foundation i Kina (nr 31741109), Hunan Natural Science Foundation (nr 2018JJ3200), och konstruera program för tillämpad karakteristisk disciplin i Hunan University of Science and Engineering. Vi tackar LetPub (www.letpub.com) för dess språkliga hjälp under utarbetandet av detta manuskript.
Materials
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
Referências
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
- Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
- Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
- Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
- Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
- Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
- Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
- Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
- Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
- Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
- Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
- Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , (2018).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
- Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
- Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
- Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
- Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
- Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
- Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
- Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
- Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).
