Evaluering af protein-protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik
Summary
Her præsenterer vi en protokol for en membran fordøjelsesteknik til fremstilling af prøver til massespektrometri. Denne teknik letter den bekvemme analyse af protein-protein interaktioner.
Abstract
Talrige intracellulære proteiner interagerer fysisk i overensstemmelse med deres intracellulære og ekstracellulære omstændigheder. Faktisk, cellulære funktioner i vid udstrækning afhænger af intracellulære protein-protein interaktioner. Derfor er forskning vedrørende disse interaktioner uundværlig for at lette forståelsen af fysiologisk processer. Co-udfældning af associerede proteiner, efterfulgt af massespektrometri (MS) analyse, gør det muligt at identificere nye protein interaktioner. I denne undersøgelse, vi har givet oplysninger om den nye teknik immunopræcipitation-væskekromatografi (LC)-MS/MS analyse kombineret med on-membran fordøjelse til analyse af protein-protein interaktioner. Denne teknik er velegnet til rå immunoprecipitants og kan forbedre gennemløb af proteomiske analyser. Mærkede rekombinante proteiner udfældede ved hjælp af specifikke antistoffer; Dernæst blev immunopræcipitanter slettet på polyvinylidendifluorid membran stykker udsat for reduktiv alkylering. Efter trypsinisering blev de Ford øjede proteinrester analyseret ved hjælp af LC-MS/MS. ved hjælp af denne teknik, vi var i stand til at identificere flere kandidat associerede proteiner. Således, denne metode er praktisk og nyttig til karakterisering af nye protein-protein interaktioner.
Introduction
Selv om proteiner spiller konstitutive roller i levende organismer, de er kontinuerligt syntetiseres, forarbejdes, og nedbrydes i det intracellulære miljø. Desuden interagerer intracellulære proteiner ofte fysisk og biokemisk, hvilket påvirker funktionen af den ene eller begge1,2,3. For eksempel er den direkte binding af spliceosome-associeret protein ligner CWC22 med eukaryote Translation Initierings faktor 4A3 (eIF4A3) nødvendig for samlingen af exon Junction Complex4. I overensstemmelse med dette, en eIF4A3 mutant, der mangler affinitet for CWC22 undlader at lette exon Junction komplekse-drevet mRNA splejsning4. Således er studiet af protein interaktioner afgørende for den præcise forståelse af fysiologisk regulering samt cellulære funktioner.
De seneste fremskridt i massespektrometri (MS) er blevet anvendt på den omfattende analyse af protein-protein interaktioner. For eksempel, co-udfældning af endogene proteiner eller eksogent indførte mærkede proteiner med deres associerede proteiner, efterfulgt af MS analyse, gør det muligt at identificere nye protein interaktioner5. Men, en stor flaskehals af MS/MS analyse er dårlig opsving fra trypticase fordøjer af protein prøver. Til gennemførelse af proteomiske analyser af celle lysater anvendes in-gel-og membran fordøjelsesteknikker generelt til at forberede MS/MS-prøver. Vi har tidligere sammenlignet en in-gel Fordøjelsesprocedure med en on-membran fordøjelse teknik6, og viste, at sidstnævnte var forbundet med bedre sekvens dækning. Polyvinylidendifluorid (PVDF) membran kan være egnet til dette formål, fordi det er mekanisk robust og modstandsdygtig over for høje koncentrationer af organiske opløsningsmidler7,8, tillader enzymatisk fordøjelse af immobiliseret proteiner i tilstedeværelse af 80% acetonitril9. Desuden kan immobilisering på en membran fremkalde konformationelle ændringer i målproteiner, hvilket fører til forbedringer i trypticase fordøjelse effektivitet10. I overensstemmelse hermed, i denne artikel, vi har beskrevet brugen af immunoprecipitation-LC/MS/MS analyse af protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik. Denne enkle metode letter den bekvemme analyse af protein-protein interaktioner selv i ikke-specialiserede laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har tidligere beskrevet en analyse af de oxidativ modifikationer af apolipoprotein B-100 i oxideret low-density lipoprotein ved hjælp LC-MS/MS indledes med en on-membran fordøjelse teknik6. I denne undersøgelse kombinerede vi denne teknik med immunopræcipitation og har identificeret flere calpain-6-associerede proteiner. Denne nye teknik repræsenterer en bekvem metode til screening for kandidat associerede proteiner. Calpain-6 er et ikke-proteolytisk medlem af den calpain proteolytiske fam…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev delvis støttet af Japan Society for fremme af videnskab KAKENHI Grant nummer 17K09869 (to AM), Japan Society for fremme af Science KAKENHI Grant nummer 15K09418 (til TM), et forskningsstipendium fra Kanehara Ichiro Medical Science Foundation og et forskningsstipendium fra Suzuken Memorial Foundation (alle til TM).
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
Referências
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
