הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.
Abstract
חלבונים תאיים רבים אינטראקציה פיזית בהתאם לנסיבות תאיים שלהם מסחטות. אכן, פונקציות הסלולר תלוי במידה רבה חלבון תאיים – אינטראקציות חלבון. לכן, המחקר הנוגע לאינטראקציות אלו הוא הכרחי להקלה על הבנת התהליכים הפיזיולוגיים. שיתוף משקעים של חלבונים משויכים, ולאחריו ניתוח ספקטרומטר המסה (MS), מאפשר זיהוי אינטראקציות של חלבונים חדשניים. במחקר זה, סיפקנו את הפרטים של הטכניקה הרומן של immunoprecipitation-נוזלי כרומטוגרפיה (LC)-MS/MS ניתוח בשילוב עם העיכול על הקרום לניתוח של חלבון-אינטראקציות החלבון. טכניקה זו מתאימה לimmunoprecipitants גולמי ויכולה לשפר את התפוקה של ניתוחים פרוטאואריים. מתויג רקומביננטי חלבונים היו זירז באמצעות נוגדנים ספציפיים; בשלב הבא, immunoprecipitants מחק על החלקים הממבראני של הממברנה, שהיו חשופים לאלקיללציה. בעקבות טריסיזציה, משקעי החלבון המשועכלים נותחו באמצעות LC-MS/MS. באמצעות טכניקה זו, הצלחנו לזהות מספר מועמדים משויכים חלבונים. כך, שיטה זו היא נוחה ושימושית לאפיון של החלבון הרומן – אינטראקציות חלבונים.
Introduction
למרות החלבונים לשחק תפקידים מחוקה באורגניזמים חיים, הם מסונתז ללא הרף, מעובד, ומושפל בסביבה תאיים. יתר על כן, חלבונים תאיים לעתים קרובות האינטראקציה פיזית ביולוגית, אשר משפיע על הפונקציה של אחד או שניהם1,2,3. לדוגמה, הכריכה הישירה של הומוCWC22 החלבון המשויך ל-איקריוטית באמצעות תרגום מסוג 4a3 (eIF4A3) הכרחית להרכבת מתחם הצומת אקסון4. בהתאם למצב זה, מוטציה eIF4A3 חסר אהדה עבור CWC22 נכשלת להקל על החדרת הצומת mRNA מונחה מורכבים מורכב של שחבור4. לפיכך, המחקר של אינטראקציות חלבונים הוא חיוני להבנה מדויקת של רגולציה הפיזיולוגית כמו גם של פונקציות סלולריות.
ההתקדמות האחרונה בספקטרומטר המסה (MS) הוחלו על הניתוח המקיף של אינטראקציות חלבונים בחלבון. למשל, שיתוף משקעים של חלבונים אנדוגני או אקסוגנבאופן ברור הציג חלבונים מתויגים עם החלבונים המשויכים שלהם, ואחריו ניתוח MS, מאפשר זיהוי של אינטראקציות החלבון הרומן5. עם זאת, בקבוק אחד גדול של ניתוח MS/MS הוא התאוששות ירודה מעיכול טריפטי של דגימות חלבון. עבור ניהול ניתוחים פרוטאומית על lysates תא, ב-ג’ל ושיטות עיכול על-ממברנה מועסקים בדרך כלל כדי להכין בדיקות MS/MS. בעבר השוונו הליך העיכול ב-ג’ל עם טכניקת העיכול6, והראה כי האחרון היה קשור כיסוי רצף טוב יותר. Pvc difluoride (pvdf) קרום עשוי להיות מתאים למטרה זו, כי היא חזקה מכנית עמידים בפני ריכוזים גבוהים של ממיסים אורגניים7,8, המתיר העיכול אנזימטי של קיבוע חלבונים בנוכחות 80% acetonitrile9. יתר על כן, השתק על קרום יכול לגרום לשינויים שינויים בחלבונים היעד, המוביל שיפורים ביעילות העיכול הטריפטי10. בהתאם לכך, במאמר זה, תיארנו את השימוש בניתוח immunoprecipitation-LC/MS/MS של אינטראקציות חלבונים באמצעות טכניקת העיכול על הממברנה. שיטה פשוטה זו מקלה על הניתוח הנוח של אינטראקציות חלבונים בחלבון גם במעבדות שאינן מתמחות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבר תיארנו ניתוח של שינויים חמצוניים של אפוליפופרוטאין B-100 ב תחמוצת בצפיפות נמוכה ליפופרוטאין באמצעות LC-ms/ms לפניו על-ידי טכניקה העיכול הממברנה6. במחקר הנוכחי, אנו משולבים טכניקה זו עם immunoprecipitation וזיהה מספר calpain-6-הקשורים חלבונים. טכניקה זו מייצגת שיטה נוחה להקרנה עבור חלבונים …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה היה נתמך בחלק על ידי החברה היפן לקידום המדע KAKENHI גרנט מספר 17K09869 (כדי AM), יפן האגודה לקידום המדע KAKENHI גרנט מספר 15K09418 (ל TM), מענק מחקר מבית החולים Kanehara איצ’ירו המדע ומענק מחקר מקרן הזיכרון של סוזוקן (all-TM).
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
Referências
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
