Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per una tecnica di digestione su membrana per la preparazione di campioni per la spettrometria di massa. Questa tecnica facilita la comoda analisi delle interazioni proteina-proteina.
Abstract
Numerose proteine intracellulari interagiscono fisicamente in conformità con le loro circostanze intracellulari ed extracellulari. Infatti, le funzioni cellulari dipendono in gran parte dalle interazioni intracellulari proteina-proteina. Pertanto, la ricerca su queste interazioni è indispensabile per facilitare la comprensione dei processi fisiologici. La co-precipitazione delle proteine associate, seguita dall’analisi della spettrometria di massa (MS), consente l’identificazione di nuove interazioni proteiche. In questo studio, abbiamo fornito dettagli della nuova tecnica di immunoprecipitazioni-liquid a cromatografia (LC)-MS/MS analisi combinata con la digestione on-membrane per l’analisi delle interazioni proteina-proteina. Questa tecnica è adatta per immunoprecipitanti grezzi e può migliorare la produttività delle analisi proteomiche. Le proteine ricombinanti marcate sono state precipitate usando anticorpi specifici; successivamente, gli immunoprecipitanti ornati su pezzi di membrana difluoruro polivichine sono stati sottoposti a alchilazione riduttiva. Dopo la prova, i residui di proteine digerite sono stati analizzati utilizzando LC-MS/MS. Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di identificare diverse proteine associate candidate. Pertanto, questo metodo è conveniente e utile per la caratterizzazione di nuove interazioni proteina-proteina.
Introduction
Anche se le proteine svolgono ruoli di stitutive negli organismi viventi, vengono continuamente sintetizzate, elaborate e degradate nell’ambiente intracellulare. Inoltre, le proteine intracellulari interagiscono frequentemente fisicamente e biochimicamente, il che influisce sulla funzione di uno o entrambi1,2,3. Ad esempio, il legame diretto dell’omologa proteica associata allo spsome CWC22 con il fattore di avvio della traduzione eucacacale 4A3 (eIF4A3) è necessaria per l’assemblaggio del complesso di giunzione esonista4. Coerentemente con questo, un mutante eIF4A3 che manca di affinità per CWC22 non riesce a facilitare lo splicing4di mRNA di giunzione esone Pertanto, lo studio delle interazioni proteiche è fondamentale per la comprensione precisa della regolazione fisiologica e delle funzioni cellulari.
Recenti progressi nella spettrometria di massa (MS) sono stati applicati all’analisi completa delle interazioni proteina-proteina. Ad esempio, la co-precipitazione di proteine endogene o proteine esogeneamente introdotte con le proteine associate, seguite dall’analisi della SM, consente l’identificazione di nuove interazioni proteiche5. Tuttavia, uno dei principali colli di bottiglia dell’analisi MS/MS è la scarsa ripresa da digerimenti a prova di campioni di proteine. Per condurre analisi proteomiche su lismi cellulari, le tecniche di digestione in gel e on-membrana sono generalmente impiegate per preparare campioni MS/MS. In precedenza abbiamo confrontato una procedura di digestione in gel con una tecnica di digestione su membrana6e abbiamo dimostrato che quest’ultima era associata a una migliore copertura della sequenza. La membrana di polivinylidene difluoruro (PVDF) può essere adatta a questo scopo perché è meccanicamente robusta e resistente ad alte concentrazioni di solventi organici7,8, permettendo la digestione enzimatica di immobilizzati proteine in presenza dell’80% di acetonitrile9. Inoltre, l’immobilizzazione su una membrana può indurre cambiamenti conformazionali nelle proteine bersaglio, portando a miglioramenti nell’efficienza della digestione a setto10 . Di conseguenza, in questo articolo, abbiamo descritto l’uso dell’immunoprecipitazioni-LC/MS/MS analisi delle interazioni proteiche utilizzando una tecnica di digestione su membrana. Questo semplice metodo facilita la comoda analisi delle interazioni proteina-proteina anche in laboratori non specialistici.
Protocol
Representative Results
Discussion
In precedenza abbiamo descritto un’analisi delle modifiche ossidative dell’apolipoproteina B-100 nella lipoproteina a bassa densità ossidata utilizzando LC-MS/MS preceduta da una tecnica di digestione su membrana6. Nel presente studio, abbiamo combinato questa tecnica con l’immunoprecipitazioni e abbiamo identificato diverse proteine associate al calpaino 6. Questa nuova tecnica rappresenta un metodo conveniente di screening per le proteine candidate candidate. Calpain-6 è un membro non proteoli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto in parte dalla Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 17K09869 (a AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (a TM), una sovvenzione di ricerca della Kanehara Ichiro Medical Science Foundation e una borsa di ricerca della Suzuken Memorial Foundation (tutte a TM).
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
Referências
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
