Kwantificering van drie DNA-laesies door massaspectrometrie en beoordeling van de niveaus in weefsels van muizen die worden blootgesteld aan omgevings fijne deeltjes

Summary

We beschrijven hier methoden voor gevoelige en accurate kwantificering van de laesies 8-Oxo-7, 8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1, n⁶-etheno-2′-deoxyadenosine (1, n⁶-dAdo) en 1,n²– etheno-2′-deoxyguanosine (1,N₂-dGuo) in DNA. De methoden werden toegepast op de beoordeling van de effecten van de omgevings fijn stof (PM_2,5) in weefsels (Long, lever en nier) van blootgestelde A/J muizen.

Abstract

DNA-adducten en geoxideerde DNA-bases zijn voorbeelden van DNA-laesies die nuttig zijn biomarkers voor de toxiciteit beoordeling van stoffen die zijn elektrofiele, het genereren van reactieve elektrofielen op biotransformatie, of induceren oxidatieve stress. Onder de geoxideerde nucleobasen, de meest bestudeerde is een 8-Oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) of 8-Oxo-7, 8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxodGuo), een biomarker van oxidatively geïnduceerde basis schade in DNA. Aldehyden en epoxyaldehydes als gevolg van het lipiden peroxidatie proces zijn elektrofiele moleculen die in staat zijn mutagene exocyclic DNA adducten te vormen, zoals de etheno adducten 1,n²-etheno-2′-Deoxyguanosine (1,n²– εdGuo) en 1,n⁶-etheno-2′-deoxyadenosine (1,n⁶-εdAdo), die als potentiële biomarkers in de pathofysiologie van ontsteking zijn voorgesteld. Selectieve en gevoelige methoden voor de kwantificering ervan in DNA zijn noodzakelijk voor de ontwikkeling van preventieve strategieën om de mutaties van cellen en de ontwikkeling van chronische ziekten te vertragen (bijv. kanker, neurodegeneratieve ziekten). Onder de gevoelige methoden die beschikbaar zijn voor hun detectie (hoge prestaties vloeibare chromatografie gekoppeld aan elektrochemische of tandem massaspectrometrie detectoren, Comet Assay, immunoassays, ³²P-postlabeling), de meest selectieve zijn die op basis op hoge prestaties vloeibare chromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie (HPLC-ESI-MS/MS). Selectiviteit is een essentieel voordeel bij het analyseren van complexe biologische monsters en HPLC-ESI-MS/MS geëvolueerd als de gouden standaard voor de kwantificering van gemodificeerde nucleosiden in biologische matrices, zoals DNA, urine, plasma en speeksel. Het gebruik van isotopically gelabeld interne normen voegt het voordeel van correcties voor molecule verliezen tijdens de DNA-hydrolyse en analyt verrijking stappen, alsmede voor de verschillen van de analyt ionisatie tussen de monsters. Het helpt ook bij de identificatie van de juiste chromatografie piek wanneer er meer dan een piek aanwezig is.

We presenteren hier gevalideerd gevoelige, accurate en nauwkeurige HPLC-ESI-MS/MS methoden die met succes werden toegepast voor de kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n⁶-Dado en 1,N²-dGuo in de Long-, lever-en nier-DNA van A/J muizen voor de beoordeling van de effecten van ambient PM_2,5 blootstelling.

Introduction

Sommige reactieve zuurstofsoorten (ROS) kunnen koolstof dubbele banden van de basissen van DNA en sommige koolstof in deoxyribose moiety oxideren, die geoxideerde basissen en de bundel onderbrekingen van DNA produceert¹. Als een negatief geladen molecuul rijk aan stikstof-en zuurstofatomen, DNA is ook een doelwit voor elektrofiele groepen die covalente reageren met de nucleofiele sites (stikstof en zuurstof), het geven van producten die worden genoemd DNA adducten². Dus, DNA-adducten en geoxideerde DNA-bases zijn voorbeelden van DNA-laesies die nuttig zijn biomarkers voor de toxiciteit beoordeling van stoffen die zijn elektrofiele, het genereren van reactieve elektrofielen op biotransformatie, of induceren oxidatieve stress^{1, 2}. Hoewel de gewijzigde DNA-bases kunnen worden verwijderd uit DNA door base of nucleotide accijns reparatie (BER of NER), de inductie van een onbalans tussen de generatie en verwijdering van DNA-laesies in het voordeel van de voormalige leidt tot een netto stijging van hun niveau in DNA overwerk^{3 . Resultaten zijn de toename van de DNA-mutatie, verminderde genexpressie, en verminderde eiwit activiteit2,4,5,6,7, effecten die nauw verwant zijn aan de ontwikkeling van ziekten. De veranderingen van DNA kunnen diverse cellulaire functies, zoals cel signalering, cel cyclus, de integriteit van het genoom, Telomere stabiliteit, de epigenome, chromatin structuur, het verbinden van RNA, eiwit homeostase, metabolisme, apoptosis, en de differentiatie van de cel beïnvloeden8 ,9. Strategieën om de mutatie tarieven van cellen en de ontwikkeling van chronische ziekten (bijv. kanker, neurodegeneratieve ziekten) te vertragen passeren de kennis van de mutatie bronnen, onder hen, DNA laesies en hun oorzaken.}

ROS gegenereerd endogene in overmaat, als gevolg van blootstelling aan verontreinigende stoffen, aanhoudende ontsteking, ziekte Pathofysiologie (bijv. diabetes), enz., zijn belangrijke oorzaken van Biomolecuul schade, met inbegrip van DNA en lipide schade¹. Als voorbeeld, de zeer reactieve hydroxyl radicale (OH) gevormd uit H₂O₂ reductie door overgang metaalionen (FE^{2 +}, Cu⁺) oxideert de DNA-bases, DNA-suiker moiety en meervoudig onverzadigde vetzuren bij diffusie-gecontroleerde tarieven¹⁰. Onder de 80 reeds gekenmerkt geoxideerd nucleobasen³, de meest bestudeerde is een 8-Oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) of 8-Oxo-7, 8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-OxodGuo, Figuur 1), een laesie die in staat is om te induceren gt-transversies in zoogdiercellen^10,11. Het wordt gevormd door de mono elektronische oxidatie van guanine, of door hydroxyl radicale of singlet zuurstof aanval van Guanine in DNA¹. Meervoudig onverzadigde vetzuren zijn andere belangrijke doelstellingen van zeer reactieve oxidanten, zoals ^•Oh, die het proces van lipide peroxidatie^1,12te initiëren. Het geeft aanleiding tot vetzuur waterstof peroxiden die kunnen ontbinden aan elektrofiele aldehyden en epoxyaldehydes, zoals malondialdehyde, 4-hydroxy-2-nonenal, 2, 4-decadienal, 4,5-epoxy-(2E)-Decena, hexenal, acroleïne, Crotonaldehyde, die bekwaam om mutagene exocyclic te vormen DNA adducten, zoals malondialdehyde-, Propano-, of etheno adducten^1,12,13. De etheno adducten 1,n²-etheno-2′-Deoxyguanosine (1,n²-εdGuo, Figuur 1) en 1,n⁶-etheno-2′-deoxyadenosine (1,n⁶-εdAdo, Figuur 1 ) zijn voorgesteld als potentiële biomarkers in de pathofysiologie van ontsteking^14,15.

Figuur 1. Chemische structuren van de DNA-laesies gekwantificeerd in de huidige studie. dR = 2 ´-deoxyribose. Dit cijfer is gewijzigd van Oliveira et al.³⁴. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

De studies die in de vroege jaren ‘ 80 worden uitgevoerd lieten de gevoelige opsporing van 8-oxodGuo door hoge prestaties vloeibare chromatografie toe die aan elektrochemische opsporing wordt gekoppeld (HPLC-ECD). De kwantificering van 8-oxodGuo door HPLC-ECD in verscheidene biologische systemen die aan oxiderende voorwaarden worden onderworpen leidde tot de erkenning van 8-oxodGuo als biomarker van oxidatively veroorzaakte basis schade in DNA^1,16. Hoewel robuust en waardoor de kwantificering van 8-oxodGuo in de lage fmol bereik¹⁷, HPLC-ECD metingen vertrouwen op de nauwkeurigheid van de analyt retentietijd voor de identificatie van de analyt en op de chromatografie resolutie om interferenties te voorkomen van andere monster bestanddelen. Aangezien de elektrochemische opsporing het gebruik van zout (b.v., kaliumfosfaat, natriumacetaat) in de mobiele fase vereist, vergt het behoud van adequate analytische voorwaarden routine kolom en materiaal het schoonmaken tijd.

Als alternatief, het gebruik van de bacteriële DNA-reparatie enzym formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) en, daarna, menselijke 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1), voor de opsporing en verwijdering van 8-oxoGua van DNA, ontstond als een manier voor de inductie van DNA-alkali labiele Sites. De alkali labiele plaatsen worden omgezet in de bundel onderbrekingen van DNA en laten de zeer hoge gevoelige indirecte kwantificering van 8-oxoGua door alkalische enige Elektroforese van het gel (de “komeet assay”) toe. De hoge gevoeligheid en de verwezenlijking van de analyses zonder de behoefte aan cellulaire DNA-extractie zijn de belangrijkste voordelen van dit type van analyse. Het geeft de laagste steady-state niveaus van 8-oxoGua in DNA, meestal 7-10 keer lager dan de niveaus verkregen door bioanalytische methoden op basis van HPLC. Het is echter een indirecte meting van 8-oxoGua en sommige nadelen zijn het gebrek aan specificiteit of de onbekende efficiëntie van de reparatie-enzymen gebruikt^1,16,18.

Immunoassays zijn andere set van methoden die worden gebruikt voor de detectie van 8-oxoGua¹ en exocyclic DNA adducten, zoals 1,n⁶-dAdo en 1,n²-dGuo¹². Ondanks de gevoeligheid, is een tekortkoming van het gebruik van antilichamen voor opsporing van de letsels van DNA het gebrek aan specificiteit toe te schrijven aan cross-reactiviteit aan andere componenten van biologische steekproeven, met inbegrip van de normale DNA-basissen^1,12. De exocyclic DNA adducten, met inbegrip van 1,n⁶-Dado en 1,n²-dGuo, kan ook worden gedetecteerd en gekwantificeerd door zeer gevoelige ³²P-postlabeling assays¹². De hoge gevoeligheid van ³²P-postlabeling staat het gebruik van zeer kleine hoeveelheden DNA toe (b.v., 10 µ g) voor opsporing van ongeveer 1 adduct per 10¹⁰ normale basissen¹⁹. Echter, het gebruik van radio-chemicaliën, gebrek aan chemische specificiteit en lage nauwkeurigheid zijn enkele nadelen^19,20.

Een gemeenschappelijke beperking van de hierboven aangehaalde methoden is de geringe selectiviteit of specificiteit voor de detectie van de gewenste moleculen. In dit scenario, HPLC gekoppeld aan electrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (HPLC-ESI-MS/MS en HPLC-MS³) geëvolueerd als de gouden standaard voor de kwantificering van gemodificeerde nucleosiden in biologische matrices, zoals DNA, urine, plasma en speeksel ^{1 , 19 , 20}. voordelen van HPLC-ESI-MS/MS methoden zijn de gevoeligheid (meestal in de lage fmol bereik) en de hoge specificiteit die door i) de chromatografie scheiding, II) de karakteristieke en bekende patroon van molecule fragmentatie in de massa de botsings kamer van de spectrometer, en III) de nauwkeurige meting van de geselecteerde massa aan lasten verhouding (m/z) in veelvoudige reactie controle wijze^1,19. Het gebruik van isotopically gelabeld interne normen voegt het voordeel van correcties voor molecule verliezen tijdens de DNA-hydrolyse en analyt verrijking stappen, alsmede voor de verschillen van de analyt ionisatie tussen de monsters. Het helpt ook bij de identificatie van de juiste chromatografie piek wanneer meer dan een piek aanwezig is^1,12,19,20.

Verschillende methoden op basis van HPLC-ESI-MS/MS zijn gebruikt voor de kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n⁶-dAdo en 1,n²-dGuo in DNA geëxtraheerd uit verschillende biologische monsters^{12,15,20 ,21},²²,^23,24,25,26,^27,28,29 . De fijne deeltjes (PM_2,5) dragen organische en anorganische chemische producten, zoals polycyclische aromatische koolwaterstoffen (pak’s), Nitro-pak’s, aldehyden, ketonen, carbonzuren, quinolines, metalen, en in water oplosbare ionen, die ontsteking kunnen veroorzaken en oxidatieve stress, voorwaarden die het voorkomen van biomolecule schade en ziekte^30,31,32,33gunst. We presenteren hier gevalideerd HPLC-ESI-MS/MS methoden die met succes werden toegepast voor de kwantificering van 8-oxodGuo, 1,n⁶-Dado en 1,n²-dGuo in Long-, lever-en nier-DNA van A/J muizen voor de beoordeling van de effecten van ambient PM_2,5 exposure³⁴.

Protocol

Vier weken oude mannelijke A/J muizen, specifieke pathogeen vrij, werden verkregen uit het broed centrum van proefdieren van Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brazilië, en werden dienovereenkomstig behandeld aan de ethische commissie van de Faculteit der Geneeskunde, Universiteit van São Paulo (protocol no 1310/09). 1. verzameling van muizen weefsels Verdoven het dier met xylazine en ketamine. Voor een muis met 30 g lichaamsgewicht, een oplossing injecte…

Representative Results

De gemiddelde concentraties van DNA (± BR) die van muizen lever (~ 1 g weefsel) worden verkregen, Long (~ 0,2 g weefsel) en nier (~ 0,4 g weefsel) waren, respectievelijk, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021, en 3.223 ± 723 µ g/mL in het uiteindelijke volume van 200 µ L. Een vertegenwoordiger chromatogram verkregen door HPLC-papa van het gezuiverde DNA wordt getoond in Figuur 3. De aanwezigheid van de vier 2 ‘-deoxynucleosides, vrij van de RNA ribonucleosides, …

Discussion

Een groot probleem dat in de 8-oxodGuo analyses door HPLC methodes wordt gevonden is de mogelijke inductie van zijn vorming tijdens de Workup procedures van de extractie van DNA, de hydrolyse van DNA, en concentratie van DNA eiwithydrolysaten^22,38. Om het probleem van 8-oxodGuo artefactuele vorming te minimaliseren, wordt het aanbevolen de toevoeging van deferoxamine aan alle DNA-extractie, opslag en hydrolyse oplossingen, het gebruik van de Natriumjodide chaotro…

Materials

[15N5]-2’-deoxyadenosine	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-3899-CA-10
acetonitrile	Carlo Erba Reagents	412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa	Sigma	P5521
ammonium acetate	Merck	101116
calf thymus DNA	Sigma	D1501
cell lysis solution	QIAGEN	158908
chloroform	Carlo Erba Reagents	412653
deferoxamine	Sigma	D9533
deoxyribonuclease I (DNase I)	Bio Basic Inc	DD0649
ethanol	Carlo Erba Reagents	414542
formic acid	Sigma-Aldrich	F0507
HPLC-ESI-MS/MS system	HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments	HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system	Shimadzu	Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18)	Phenomenex	00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18)	Phenomenex	00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18)	Phenomenex	00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)	Phenomenex	AJO-4287
isoamyl alcohol	Sigma-Aldrich	M32658
isopropyl alcohol (isopropanol)	Carlo Erba Reagents	A412790010
ketamine	Ceva	Commercial name: Dopalen
magnesium chloride	Carlo Erba Reagents	349377
magnesium chloride	Sigma	M2393
methanol	Carlo Erba Reagents	L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox	Sigma	P4506
protein precipitation solution	QIAGEN	158912
proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308
ribonuclease A	Sigma	R5000
sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625
SPE-C18 (Strata-X)	Phenomenex	8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Carlo Erba Reagents	489983
xylazine	Syntec do Brasil	Commercial name: Xilazin