मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा तीन डीएनए घावों का परिमाणीकरण और परिवेशी महीन पार्टिकुलेट मैटर के संपर्क में आने वाले चूहों के ऊतकों में उनके स्तरों का आकलन
Summary
हम यहाँ घावों के संवेदनशील और सटीक परिमाणन के लिए विधियां वर्णित करते हैं 8-ऑक्सो-7, 8-डाइहाइड्रो-2′-डिऑक्सीग्वानोसिन (8-ऑक्सोडगुओ), 1,एन6-एथनो-2′-डिऑक्सिडेनोसीन (1,एन6-दाडो) और 1,n2– एथिनो-2′-डीऑक्सीग्वानोसिन (1,N2-DGUO) डीएनए में । इन पद्धतियों को एक/J चूहों के ऊतकों (फेफड़ों, यकृत और गुर्दे) में परिवेशी महीन पार्टिकुलेट मैटर (पीएम२.५) के प्रभाव के आकलन के लिए लागू किया गया था ।
Abstract
डीएनए की अभिनलिकाएं और ऑक्सीकृत डीएनए आधार डीएनए के घावों के उदाहरण हैं जो इलेक्ट्रोफिलिक पदार्थों के विषाक्तता आकलन के लिए उपयोगी बायोमार्कर हैं, बायोट्रांसफॉर्मेशन पर प्रतिक्रियाशील इलेक्ट्रोफिलिस उत्पन्न करते हैं, या ऑक्सीडेटिव तनाव पैदा करते हैं । ऑक्सीकरण नाभिक के बीच, सबसे अधिक अध्ययन किया गया है 8-ऑक्सो-7, 8-डाइहाइड्रोग्वानिन (8-ऑक्सोगुआ) या 8-ऑक्सो-7, 8-डाइहाइड्रो-2′-डिऑक्सीग्नॉसीन लिपिड परऑक्सीकरण प्रक्रिया के परिणामस्वरूप होने वाले ऐल्डिहाइडों और epoxyaldehydes हैं-इलेक्ट्रोफिलिक अणुओं के रूप में कर सकते हैं mutagenic exocyclic डीएनए adनलिकाओं, जैसे etheno adनलिकाएं 1,N2-etheno-2′-deoxyguanosine (1,n2– εdGuo) और 1,n6-etheno-2′-डिऑक्सिडेनोसिन (1,n6-εdado), जिसे प्रदाह के रोगपादाशय में संभावित बायोमार्कर के रूप में सुझाया गया है । डीएनए में उनकी मात्रा के लिए चयनात्मक और संवेदनशील तरीकों कोशिका उत्परिवर्तन दरों और जीर्ण रोग विकास (जैसे, कैंसर, न्यूरोडिजेनेरेटिव रोगों) को धीमा करने के लिए निवारक रणनीतियों के विकास के लिए आवश्यक हैं । उनके पता लगाने के लिए उपलब्ध संवेदनशील तरीकों में से (उच्च प्रदर्शन तरल वर्णलेखिकी इलेक्ट्रोकेमिकल या मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री डिटेक्टरों करने के लिए युग्मित, धूमकेतु परख, immunoassays हैं, ३२पी-postlabeling), सबसे चयनात्मक उन आधारित हैं उच्च प्रदर्शन तरल वर्णलेखिकी पर मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस) को युग्मित । चयनात्मकता जटिल जैविक नमूनों और HPLC-ईएसआई-MS/MS का विश्लेषण करने के लिए एक आवश्यक लाभ है, डीएनए, मूत्र, प्लाज्मा और लार जैसे जैविक matrices में संशोधित न्यूकोसाइड की मात्रा के लिए सोने के मानक के रूप में विकसित. Isotopically लेबल आंतरिक मानकों का उपयोग डीएनए हाइड्रोलिसिस और analyte संवर्धन कदम के दौरान अणु हानि के लिए सुधार का लाभ कहते हैं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूनों के बीच analyte आयनन के मतभेदों के लिए । इसमें एक से अधिक चोटी मौजूद होने पर सही क्रोमेटोग्राफिक पीक की पहचान में भी एड्स होता है ।
हम यहां मौजूद संवेदनशील, सटीक और सटीक HPLC-ईएसआई-MS/MS तरीकों कि सफलतापूर्वक 8 की मात्रा के लिए आवेदन किया गया-oxodGuo, 1,n6-दाओ और 1,n2-फेफड़ों में dguo, जिगर और एक के गुर्दे डीएनए/ परिवेशी पीएम२.५ एक्सपोजर के प्रभावों का आकलन ।
Introduction
कुछ प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओज) डीएनए अड्डों के कार्बन डबल बांड और डीऑक्सीराइबोस मोइटी में कुछ कार्बनऑक्सिडाइज़ करने में सक्षम हैं, ऑक्सीकरण अड्डों और डीएनए कतरा को पैदा करते हैं1टूट जाता है । नाइट्रोजन और ऑक्सीजन परमाणुओं से समृद्ध एक नकारात्मक आवेशित अणु के रूप में, डीएनए भी इलेक्ट्रोफिलिक समूहों के लिए एक लक्ष्य है, जो नाभिकरागिता वाले स्थलों (नाइट्रोजन और ऑक्सीजन) के साथ सह प्रतिक्रिया करता है, जो उन उत्पादों को प्रदान करता है जिन्हें डीएनए adनलिकाओं2कहते हैं । तो, डीएनए adनलिकाएं और ऑक्सीकरण डीएनए ठिकानों डीएनए घावों है कि पदार्थों है कि electrophilic हैं के विषाक्तता आकलन के लिए उपयोगी biomarkers हैं, biotransformation पर प्रतिक्रियाशील electrophilic उत्पन्न, या ऑक्सीडेटिव तनाव1प्रेरित करने के उदाहरण हैं, २। हालांकि संशोधित डीएनए अड्डों को आधार या न्यूकोटाइड उच्छेदन (ईआर या एनईआर) द्वारा डीएनए से हटाया जा सकता है, लेकिन पूर्व के पक्ष में डीएनए घावों के उत्पादन और निष्कासन के बीच असंतुलन का प्रेरण डीएनए ओवरटाइम में उनके स्तर की एक शुद्ध वृद्धि करने के लिए होता है3 । परिणाम डीएनए उत्परिवर्तन दरों की वृद्धि हुई है, कम जीन अभिव्यक्ति, और कम प्रोटीन गतिविधि2,4,5,6,7, प्रभाव है कि बारीकी से संबंधित है रोगों का विकास । डीएनए म्यूटेशन सेल सिग्नलिंग, कोशिका चक्र, जीनोम अखंडता, telomere स्थिरता, epigenome, क्रोमेटिन संरचना, आरएनए splicing, प्रोटीन homeostasis, चयापचय, apoptosis, और कोशिका विभेदन के रूप में विभिन्न सेलुलर कार्यों, प्रभावित हो सकता है8 ,9. सेल म्यूटेशन दरों को धीमा करने के लिए रणनीतियां और जीर्ण रोग विकास (उदा., कैंसर, न्यूरोडिजेनेरेटिव रोग), उनमें से, डीएनए घावों और उनके कारणों के बीच उत्परिवर्तन स्रोतों के ज्ञान के माध्यम से गुजरती हैं ।
अधिक में endogenously उत्पंन ROS, प्रदूषक जोखिम के कारण, लगातार सूजन, रोग रोगविज्ञान (जैसे, मधुमेह), आदि, डीएनए और लिपिड नुकसान1सहित biomolecule क्षति के महत्वपूर्ण कारण हैं । एक उदाहरण के रूप में, उच्च प्रतिक्रियाशील हाइड्रॉक्सिल रेडिकल (OH) संक्रमण धातु आयन (Fe2 +, Cu+) द्वारा एच2ओ2 की कमी से बना डीएनए कुर्सियां, डीएनए चीनी मोइटी और पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड पर प्रसार-नियंत्रित oxidizes 10दरें । ८० पहले से ही ऑक्सीकरण nucleobases3विशेषता में, सबसे अधिक अध्ययन किया गया है एक 8-oxo-7, 8-dihydroguanine (8-ऑक्सीकरण) या 8-oxo-7, 8-diहाइड्रो-2′-deoxyguanosine (8-oxodguo, चित्रा 1), एक घाव है कि जीटी transversions में प्रेरित करने में सक्षम है स्तनधारी कोशिकाओं10,11। यह ग्वानिन के मोनो इलेक्ट्रॉनिक ऑक्सीकरण द्वारा, या डीएनए1में ग्वानीन के हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी या सिंगिंग ऑक्सीजन हमले के द्वारा बनाई गई है । पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड अत्यधिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीडेन्ट्स के अन्य महत्वपूर्ण लक्ष्य होते हैं, जैसे कि •ओह, जो लिपिड परऑक्सीकरण1,12की प्रक्रिया आरंभ करते हैं । यह फैटी एसिड hydroperoxides कि इलेक्ट्रोफिलिक aldehydes और epoxyaldehydes को विघटित कर सकते है वृद्धि देता है, जैसे मैलोन्डिहाइड, 4-हाइड्रोक्सी-2-नॉननेरल, 2, 4-डेकाडियोल, 4, 5-एपोक्सी-(2ई)-डेसीनल, हैक्सानियल, एक्रोलेइन, क्रॉटोनल्डिहाइड, जो 1,12,13या etheno adनलिकाओं-जैसे मैलोन्डिहाइड-, propano-, या एथेनो के रूप में उत्परिवर्तनिक exocyclic डीएनए adनलिकाओं, बनाने के लिए सक्षम. Etheno adनलिकाएं 1,n2-etheno-2′-deoxyguanosine (1,n2-εdguo, चित्रा 1) और 1,n6-Etheno-2′-deoxyguanosine (1,n6-εदाओ, चित्रा 1 ) सूजन14,15के pathophysiology में संभावित biomarkers के रूप में सुझाव दिया गया है.
चित्रा 1 । वर्तमान अध्ययन में डीएनए के घावों की रासायनिक संरचनाओं का परिमाण निर्धारित है । डॉ = 2 ́-डीऑक्सीराइबोस । यह आंकड़ा Oliveira एट अल.३४से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
1980 के दशक के आरंभ में किए गए अध्ययनों में उच्च निष्पादन वाले द्रव क्रोमेटोग्राफी के द्वारा 8-ऑक्सोडगूओ को वैद्युत-रासायनिक संसूचन (एचपीएलसी-ईसीडी) से संयोजित करने की अनुमति दी गई थी । एचपीएलसी द्वारा 8 ऑक्सोडगुओ का परिमाणीकरण-ecd कई जैविक प्रणालियों में ऑक्सीकरण की स्थिति के अधीन 8-oxodguo की मांयता के लिए नेतृत्व में oxidatively प्रेरित आधार नुकसान के एक biomarker के रूप में डीएनए1,16। हालांकि मजबूत और 8-oxodGuo की मात्रा कम fmol रेंज17में, HPLC-ecd मापन की अनुमति के विश्लेषण के लिए analyte प्रतिधारण समय की सटीकता पर भरोसा करते है और क्रोमेटोग्राफी संकल्प पर interferences से बचने के लिए अंय नमूना घटक है । चूंकि इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन के लिए मोबाइल फेज में सॉल्ट (मसलन, पोटैशियम फॉस्फेट, सोडियम एसीटेट) के इस्तेमाल की जरूरत होती है, इसलिए पर्याप्त विश्लेषणात्मक स्थितियों के रखरखाव के लिए रूटीन कॉलम और उपकरणों की सफाई का समय चाहिए होता है ।
वैकल्पिक रूप से, डीएनए से 8-oxoगुआ का पता लगाने और हटाने के लिए बैक्टीरिया डीएनए मरंमत एंजाइम formamidopyrimidine डीएनए glycosylase (fpg) का उपयोग करें और, बाद में, मानव 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1), डीएनए क्षार अस्थिर के प्रेरण के लिए एक रास्ते के रूप में उभरा साइटों. क्षार अस्थिर साइटों डीएनए भूग्रस्त टूट जाता है और क्षारीय एकल कोशिका जेल वैद्युतकणसंचलन (“धूमकेतु परख”) से 8-oxogua की बहुत उच्च संवेदनशील अप्रत्यक्ष प्रमात्रीकरण की अनुमति देते हैं । उच्च संवेदनशीलता और सेलुलर डीएनए निष्कर्षण की आवश्यकता के बिना विश्लेषण की सिद्धि परख के इस प्रकार के मुख्य लाभ हैं । यह डीएनए में 8-oxoGua के सबसे कम स्थिर राज्य स्तर देता है, आमतौर पर 7-10 बार एचपीएलसी पर आधारित bioanalytical तरीकों से प्राप्त स्तरों से कम है । हालांकि, यह 8-oxogua की एक अप्रत्यक्ष माप है और कुछ कमियां विशिष्टता की कमी या मरंमत एंजाइमों की अज्ञात दक्षता1,16,18इस्तेमाल कर रहे हैं ।
इम्यूनोएसकहते हैं, 8-oxoGua1 और exocyclic डीएनए adनलिकाओं, जैसे 1,n6-दाओ और 1,n2-dguo12का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के अन्य सेट कर रहे हैं । संवेदनशीलता के बावजूद, डीएनए घावों का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी के उपयोग की कमी, सामान्य डीएनए आधारों1,12सहित जैविक नमूनों के अन्य घटकों को क्रॉस-रीएक्टिविटी के कारण विशिष्टता का अभाव है । 1, छ-दाडो तथा 1 एएन2-डगूओ सहित बहिर्चक्रीय डीएनए अभिनलिकाओं का भी पता लगाया जा सकता है और अत्यधिक संवेदनशील ३२पी-पोस्टलेबलिंग द्वारा मात्रा का निर्धारण किया जाता है । ३२पी-पोस्टलेबलिंग की उच्च संवेदनशीलता की अनुमति देता है डीएनए की बहुत छोटी मात्रा का उपयोग (जैसे, 10 μg) के बारे में पता लगाने के लिए 1 योगोत्पाद प्रति 1010 सामांय कुर्सियां19। हालांकि, रेडियो रसायनों का उपयोग, रासायनिक विशिष्टता और कम सटीकता की कमी कुछ नुकसान कर रहे है19,20।
ऊपर उद्धृत तरीकों की एक साझा सीमा वांछित अणुओं की खोज के लिए कम चयनशीलता या विशिष्टता है । इस परिदृश्य में, hplc इलेक्ट्रोस्प्रे आयनन मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (hplc-ईएसआई-एमएस/एमएस और hplc-ms3) के लिए युग्मित डीएनए, मूत्र, प्लाज्मा और लार के रूप में जैविक matrices में संशोधित न्यूकोसाइड्स की मात्रा का निर्धारण करने के लिए सोने के मानक के रूप में विकसित 1 । , 19 , hplc के लाभ-ईएसआई-MS/ms तरीकों संवेदनशीलता (आम तौर पर कम fmol रेंज में हैं) और उच्च विशिष्टता मैं द्वारा प्रदान की) वर्णलेखी जुदाई, द्वितीय) द्रव्यमान के अंदर अणु विखंडन की विशेषता और ज्ञात पैटर्न स्पेक्ट्रोमीटर संघट्ट कक्ष, और iii) कई प्रतिक्रिया निगरानी मोड1,19में चार्ज अनुपात (एम/जेड) के लिए चयनित द्रव्यमान का सही माप । Isotopically लेबल आंतरिक मानकों का उपयोग डीएनए हाइड्रोलिसिस और analyte संवर्धन कदम के दौरान अणु हानि के लिए सुधार का लाभ कहते हैं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूनों के बीच analyte आयनन के मतभेदों के लिए । यह भी सही क्रोमेटोग्राफिक चोटी की पहचान में एड्स जब एक से अधिक चोटी मौजूद है1,12,19,20।
एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस पर आधारित अनेक तरीकों का उपयोग विभिन्न जैविक नमूनों से निकाले गए डीएनए में 8-ऑक्सोडगुओ, 1,एन6-दाडो और 1,एन2-डगूओ के परिमाणके लिए किया गया है । ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . महीन कणों (पीएम२.५) में जैविक और अकार्बनिक रसायन होते हैं, जैसे कि पॉलीसाइक्लिक एरोमैटिक हाइड्रोकार्बन (pahs), नाइट्रो-pahs, एल्डिहाइड्स, कीटोन्स, कार्बोक्सिलिक एसिड, क्विनोलाइंस, मेटल, और पानी में घुलनशील आयन, जो सूजन को प्रेरित कर सकते हैं और ऑक्सीडेटिव तनाव, स्थितियों है कि biomolecule क्षति और रोग की घटना एहसान30,31,३२,३३. हम यहां मौजूद HPLC-ईएसआई-MS/MS तरीकों कि सफलतापूर्वक 8 की मात्रा-oxodGuo, 1,n6-दासो और 1,n2-Dguo फेफड़ों में, जिगर और एक के मूल्यांकन के लिए/ परिवेशी प्रधानमंत्री२.५ एक्सपोजर३४के प्रभाव ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एचपीएलसी विधियों द्वारा 8-oxodguo विश्लेषण में पाया एक प्रमुख समस्या डीएनए निष्कर्षण, डीएनए hydrolysis के workup प्रक्रियाओं के दौरान इसके गठन के संभावित शामिल है, और डीएनए hydrolysis की एकाग्रता22,३८। 8…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
FAPESP (Fundação डे Amparo à Pesquisa क्या Estado de साओ पाउलो, Proc. 2012/22190-3 और 2012/08616-8), CNPq (Proc. 454214/2014-6 और 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-रिटोरिया डी Pesquisa डा Universidade de साओ पाउलो), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FAPESP/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), झपकी Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) और CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8) । टी एफ Oliveira और ए एफ Oliveira FAPESP (Proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) और CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento डे Pessoal डी Nível बेहतर) से छात्रवृत्ति प्राप्त की । एम. एच. जी. मेडेरोस, पी. डी. Mascio, पी. एच. एन. साल्दिवा और ए. पी. एम. लोरेरो ने CNPq से फैलोशिप प्राप्त की |
कुछ आंकड़े और इस काम में मौजूद तालिकाओं मूलतः Oliveira A.A.F. एट अल. Genotoxic और epigenotoxic प्रभाव में प्रकाशित किया गया चूहों में केंद्रित परिवेश ठीक पार्टिकुलेट मैटर (पीएम२.५) साओ पाउलो शहर, ब्राज़िल से अवगत कराया । कण और फाइबर विष विज्ञान । 15, ४० (२०१८) ।
Materials
| [15N5]-2’-deoxyadenosine | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-3895-25 | |
| [15N5]-2’-deoxyguanosine | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-3899-CA-10 | |
| acetonitrile | Carlo Erba Reagents | 412413000 | |
| alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa | Sigma | P5521 | |
| ammonium acetate | Merck | 101116 | |
| calf thymus DNA | Sigma | D1501 | |
| cell lysis solution | QIAGEN | 158908 | |
| chloroform | Carlo Erba Reagents | 412653 | |
| deferoxamine | Sigma | D9533 | |
| deoxyribonuclease I (DNase I) | Bio Basic Inc | DD0649 | |
| ethanol | Carlo Erba Reagents | 414542 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 | |
| HPLC-ESI-MS/MS system | HPLC: Agilent 1200 series ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments | HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C). ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP. | |
| HPLC/DAD system | Shimadzu | Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP) | |
| HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18) | Phenomenex | 00B-4446-B0 | |
| HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18) | Phenomenex | 00F-4251-B0 | |
| HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18) | Phenomenex | 00G-4252-E0 | |
| HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.) | Phenomenex | AJO-4287 | |
| isoamyl alcohol | Sigma-Aldrich | M32658 | |
| isopropyl alcohol (isopropanol) | Carlo Erba Reagents | A412790010 | |
| ketamine | Ceva | Commercial name: Dopalen | |
| magnesium chloride | Carlo Erba Reagents | 349377 | |
| magnesium chloride | Sigma | M2393 | |
| methanol | Carlo Erba Reagents | L022909K7 | |
| phosphodiesterase I from Crotalus atrox | Sigma | P4506 | |
| protein precipitation solution | QIAGEN | 158912 | |
| proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| ribonuclease A | Sigma | R5000 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| SPE-C18 (Strata-X) | Phenomenex | 8B-S100-TAK | |
| tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Carlo Erba Reagents | 489983 | |
| xylazine | Syntec do Brasil | Commercial name: Xilazin |
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