Quantificazione di tre lesioni del DNA mediante spettrometria di massa e valutazione dei loro livelli nei tessuti di topi esposti a particolato fine ambientale

Summary

Descriviamo qui metodi per la quantificazione sensibile e accurata delle lesioni 8-oxo-7, 8-diidro-2′-deossiguanosina (8-oxodGuo), 1,n⁶-etheno-2′-deossiadenosina (1,n⁶-dAdo) e 1,n²– etheno-2a ‘-deossiguanosina (1,N₂-DGUO) nel DNA. I metodi sono stati applicati alla valutazione degli effetti del particolato fine ambientale (PM_2,5) nei tessuti (polmone, fegato e rene) dei topi a/J esposti.

Abstract

Gli addotti del DNA e le basi di DNA ossidato sono esempi di lesioni del DNA che sono biomarcatori utili per la valutazione della tossicità di sostanze che sono elettrofiliche, generano elettrofili reattivi sulla biotrasformazione o inducono lo stress ossidativo. Tra i nucleobasi ossidati, il più studiato è 8-oxo-7, 8-diidroguanina (8-oxoGua) o 8-oxo-7, 8-diidro-2′-deossiguanosina (8-oxodGuo), un biomarcatore di danno di base ossidativamente indotto nel DNA. Aldeidi ed epoxyaldeidi risultanti dal processo di perossidazione lipidica sono molecole elettrofiliche in grado di formare addotti mutageni del DNA esociclico, come gli addotti addotti 1,n²-addotti-2′-deoxyguanosina (1,n²– εdGuo) e 1,n⁶-etheno-2′-deossiadenosina (1,n⁶-εdado), che sono stati suggeriti come potenziali biomarcatori nella fisiopatologia dell’infiammazione. Metodi selettivi e sensibili per la loro quantificazione nel DNA sono necessari per lo sviluppo di strategie preventive per rallentare i tassi di mutazione cellulare e lo sviluppo di malattie croniche (ad esempio, cancro, malattie neurodegenerative). Tra i metodi sensibili disponibili per la loro rilevazione (cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata ai rivelatori di spettrometria di massa elettrochimica o tandem, test Comet, immunodosaggi, ³²P-postetichettatura), le più selettive sono quelle basate su cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa tandem (HPLC-ESI-MS/MS). La selettività è un vantaggio essenziale nell’analisi di campioni biologici complessi e l’HPLC-ESI-MS/MS si è evoluto come lo standard Gold per la quantificazione dei nucleosidi modificati nelle matrici biologiche, come il DNA, l’urina, il plasma e la saliva. L’uso di standard interni con etichetta isotopica aggiunge il vantaggio delle correzioni per le perdite di molecola durante le fasi di arricchimento dell’idrolisi e dell’analita del DNA, nonché per le differenze di ionizzazione dell’analita tra i campioni. Aiuta anche a identificare il picco cromatografico corretto quando è presente più di un picco.

Qui vi presentiamo i metodi HPLC-ESI-MS/MS, sensibili, accurati e precisi, che sono stati applicati con successo per la quantificazione di 8-oxodGuo, 1,n⁶-dado e 1,n²-DGUO nel polmone, nel fegato e nel DNA dei reni dei topi a/J per valutazione degli effetti dell’esposizione ambientale PM_2,5 .

Introduction

Alcune specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono in grado di ossidare doppi legami di carbonio di basi di DNA e alcuni carboni nella frazione desossribosio, generando basi ossidate e rottura del filamento del DNA¹. Come una molecola carica negativamente ricca di atomi di azoto e ossigeno, il DNA è anche un bersaglio per i gruppi elettrofilici che covalentemente reagiscono con i siti nucleofili (azoto e ossigeno), dando prodotti che sono chiamati addotti del DNA². Quindi, gli addotti del DNA e le basi del DNA ossidato sono esempi di lesioni del DNA che sono biomarcatori utili per la valutazione della tossicità di sostanze che sono elettrofiliche, generano elettrofili reattivi sulla biotrasformazione, o inducono lo stress ossidativo^{1, 2}. il Anche se le basi di DNA modificate possono essere rimosse dal DNA per riparazione di escissione di base o nucleotide (BER o NER), l’induzione di uno squilibrio tra la generazione e la rimozione delle lesioni del DNA a favore della prima porta ad un aumento netto dei loro livelli nel lavoro straordinario del DNA^{3 . I risultati sono l’aumento dei tassi di mutazione del DNA, la riduzione dell’espressione genica e la diminuita attività proteica2,4,5,6,7, effetti che sono strettamente correlati alla sviluppo di malattie. Le mutazioni del DNA possono influenzare diverse funzioni cellulari, come la segnalazione cellulare, il ciclo cellulare, l’integrità del genoma, la stabilità dei telomeri, l’epigenoma, la struttura della cromatina, lo splicing dell’RNA, l’omeostasi proteica, il metabolismo, l’apoptosi e la differenziazione cellulare8 ,9. Le strategie per rallentare i tassi di mutazione cellulare e lo sviluppo di malattie croniche (ad esempio, cancro, malattie neurodegenerative) passano attraverso la conoscenza delle fonti di mutazione, tra cui le lesioni del DNA e le loro cause.}

ROS ha generato in eccesso in modo endogeno, a causa di esposizione di inquinanti, infiammazione persistente, patofisiologia della malattia (ad esempio, diabete), ecc., sono cause importanti di danni biomolecola, tra cui il danno del DNA e del lipido¹. Ad esempio, il radicale idrossile altamente reattivo (OH) formato da H₂O₂ riduzione degli ioni metallici di transizione (Fe^{2 +}, cu⁺) ossida le basi del DNA, la porzione di zucchero del DNA e gli acidi grassi polinsaturi a diffusione controllata tassi di cambio¹⁰. Tra i 80 già caratterizzati nucleobasi ossidate³, l’uno più studiato è 8-oxo-7, 8-diidroguanina (8-oxoGua) o 8-oxo-7, 8-dihydro-2′-deossiguanosina (8-oxodGuo, Figura 1), una lesione che è in grado di indurre le trasversioni gt in cellule di mammifero^10,11. È formata dall’ossidazione mono-elettronica della guanina, o da un attacco di ossigeno radicale idrossile o singollet di guanina nel DNA¹. Gli acidi grassi polinsaturi sono altri importanti bersagli di ossidanti altamente reattivi, quali ^•Oh, che avviano il processo di perossidazione lipidica^1,12. Dà origine a idroperossidi di acidi grassi che possono decomporre a aldeidi elettrofiliche ed epoxyaldeidi, come malondialdeide, 4-idrossi-2-nonenal, 2, 4-decadienal, 4,5-epossidico-(2E)-decenale, hexenal, Acrolein, crotonaldeide, che sono in grado di formare addotti mutageni del DNA esociclico, come malondialdeide-, propano-, o addotti di addotti^1,12,13. L’addotti addotti 1,n²-addotti-2′-deoxyguanosine (1,n²-εdguo, Figura 1) e 1,n⁶-addotti-2′-deossiadenosina (1,n⁶-εdado, Figura 1 ) sono stati suggeriti come potenziali biomarcatori nella patofisiologia dell’infiammazione^14,15.

Figura 1. Strutture chimiche delle lesioni del DNA quantificate nel presente studio. dR = 2 ́-desossribosio. Questa cifra è stata modificata da Oliveira et al.³⁴. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Gli studi condotti nei primi anni ottanta hanno permesso la rilevazione sensibile di 8-oxodGuo mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata al rilevamento elettrochimico (HPLC-ECD). Quantificazione di 8-oxodGuo da HPLC-ECD in diversi sistemi biologici sottoposti a condizioni ossidanti ha portato al riconoscimento di 8-oxodGuo come un biomarcatore di danno base ossidativamente indotto in DNA^1,16. Sebbene robusto e che consenta la quantificazione di 8-oxodGuo nella gamma bassa fmol¹⁷, le misurazioni HPLC-ECD si basano sull’accuratezza del tempo di ritenzione dell’analita per l’identificazione dell’analita e sulla risoluzione della cromatografia per evitare interferenze di altri costituenti campione. Poiché la rilevazione elettrochimica richiede l’uso di sale (ad esempio fosfato di potassio, acetato di sodio) nella fase mobile, il mantenimento di condizioni analitiche adeguate necessita di routine di pulizia delle colonne e delle attrezzature.

In alternativa, l’uso dell’enzima di riparazione del DNA batterico formamidopirimidina DNA glicosilasi (FPG) e, successivamente, umana 8-oxoguanina glicosilasi 1 (hOGG1), per il rilevamento e la rimozione di 8-oxoGua dal DNA, è emerso come un modo per l’induzione del DNA alcalino labile Siti. I siti alcalini labili vengono convertiti in rotture del filamento del DNA e consentono la quantificazione indiretta molto elevata sensibile di 8-oxoGua mediante elettroforesi di gel monocellulare alcalina (“saggio Comet”). L’alta sensibilità e la realizzazione delle analisi senza la necessità di estrazione del DNA cellulare sono i principali vantaggi di questo tipo di saggio. Fornisce i livelli più bassi di stato stazionario di 8-oxoGua nel DNA, tipicamente 7-10 volte inferiori ai livelli ottenuti dai metodi bioanalitici basati su HPLC. Tuttavia, è una misura indiretta di 8-oxogua e alcuni inconvenienti sono la mancanza di specificità o l’efficienza sconosciuta degli enzimi di riparazione utilizzati^1,16,18.

Gli immunodosaggi sono altri metodi utilizzati per la rilevazione di addotti di 8-oxoGua¹ e di DNA esociclico, come 1,n⁶-dAdo e 1,n²-dGuo¹². Nonostante la sensibilità, una carenza dell’uso di anticorpi per il rilevamento delle lesioni del DNA è la mancanza di specificità a causa della reattività incrociata ad altri componenti di campioni biologici, comprese le normali basi di DNA^1,12. Gli addotti del DNA exociclico, compresi 1, n⁶-dado e 1, n²-dGuo, possono essere rilevati e quantificati da ³²P-saggi di postetichettatura¹². L’elevata sensibilità di ³²P-postetichettatura consente l’uso di piccolissime quantità di DNA (ad es. 10 μg) per il rilevamento di circa 1 addotto per 10¹⁰ basi normali¹⁹. Tuttavia, l’uso di radio-chimiche, mancanza di specificità chimica e bassa precisione sono alcuni svantaggi^19,20.

Una limitazione condivisa dei metodi citati sopra è la bassa selettività o specificità per la rilevazione delle molecole desiderate. In questo scenario, l’HPLC accoppiato alla spettrometria di massa tandem a ionizzazione elettrospray (HPLC-ESI-MS/MS e HPLC-MS³) si è evoluto come lo standard Gold per la quantificazione dei nucleosidi modificati nelle matrici biologiche, come il DNA, l’urina, il plasma e la saliva ¹ il ^{, 19} anni di ^{, 20}. i vantaggi dei metodi HPLC-ESI-MS/MS sono la sensibilità (tipicamente nella gamma bassa fmol) e l’elevata specificità fornita da i) la separazione cromatografica, II) il modello caratteristico e noto della frammentazione molecolare all’interno della massa Camera di collisione dello spettrometro, e III) la misurazione accurata del rapporto massa/carica selezionato (m/z) in modalità di monitoraggio a reazione multipla^1,19. L’uso di standard interni con etichetta isotopica aggiunge il vantaggio delle correzioni per le perdite di molecola durante le fasi di arricchimento dell’idrolisi e dell’analita del DNA, nonché per le differenze di ionizzazione dell’analita tra i campioni. Aiuta anche a identificare il picco cromatografico corretto quando più di un picco è presente^1,12,19,20.

Diversi metodi basati su HPLC-ESI-MS/MS sono stati utilizzati per la quantificazione di 8-oxodGuo, 1,N⁶-dAdo e 1,n²-dGuo nel DNA Estratto da diversi campioni biologici^{12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29} . Le particelle sottili (PM_2,5) trasportano sostanze chimiche organiche e inorganiche, quali idrocarburi policiclici aromatici (IPA), Nitro-IPA, aldeidi, chetoni, acidi carbossilici, chinolini, metalli e ioni solubili in acqua, che possono indurre infiammazione e stress ossidativo, condizioni che favoriscono il verificarsi di biomolecola danni e malattia³⁰,^31,32,33. Qui presentiamo i metodi HPLC-ESI-MS/MS convalidati che sono stati applicati con successo per la quantificazione di 8-oxodGuo, 1,n⁶-dado e 1,n²-dGuo in polmone, fegato e DNA renale di un/J topi per la valutazione del effetti dell’esposizione ambientale PM 2,5³⁴.

Protocol

Quattro settimana vecchio maschio A/J topi, patogeno specifico libero, sono stati ottenuti dal centro di allevamento di animali da laboratorio di Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasile, e sono stati trattati di conseguenza al comitato etico della facoltà di medicina, Università di San Paolo (protocollo no 1310/09). 1. raccolta dei tessuti dei topi Anestetizzare l’animale con xylazina e chetamina. Per un topo con 30 g di peso corporeo, iniettare una so…

Representative Results

Le concentrazioni medie di DNA (± DS) ottenute da topi epatici (~ 1 g di tessuto), polmone (~ 0,2 g di tessuto) e rene (~ 0,4 g di tessuto) erano, rispettivamente, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021, e 3.223 ± 723 μg/mL nel volume finale di 200 μL. Un cromatogramma rappresentativo ottenuto da HPLC-DAD del DNA purificato è mostrato in Figura 3. La presenza dei quattro 2′-deossinucleosidi, esenti dai ribonucleosidi dell’RNA, che eluto immediatamente prima dei …

Discussion

Un problema importante riscontrato nelle analisi 8-oxodGuo da HPLC Metodi è la possibile induzione della sua formazione durante le procedure di esame di estrazione del DNA, idrolisi del DNA, e la concentrazione di DNA idrolizzati^22,38. Al fine di minimizzare il problema della formazione di 8-oxodGuo smontava, si raccomanda l’aggiunta di deferossamina a tutte le soluzioni di estrazione, stoccaggio e idrolisi del DNA, l’uso del metodo chaotropico ioduro di sodio e…

Materials

[15N5]-2’-deoxyadenosine	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-3899-CA-10
acetonitrile	Carlo Erba Reagents	412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa	Sigma	P5521
ammonium acetate	Merck	101116
calf thymus DNA	Sigma	D1501
cell lysis solution	QIAGEN	158908
chloroform	Carlo Erba Reagents	412653
deferoxamine	Sigma	D9533
deoxyribonuclease I (DNase I)	Bio Basic Inc	DD0649
ethanol	Carlo Erba Reagents	414542
formic acid	Sigma-Aldrich	F0507
HPLC-ESI-MS/MS system	HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments	HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system	Shimadzu	Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18)	Phenomenex	00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18)	Phenomenex	00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18)	Phenomenex	00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)	Phenomenex	AJO-4287
isoamyl alcohol	Sigma-Aldrich	M32658
isopropyl alcohol (isopropanol)	Carlo Erba Reagents	A412790010
ketamine	Ceva	Commercial name: Dopalen
magnesium chloride	Carlo Erba Reagents	349377
magnesium chloride	Sigma	M2393
methanol	Carlo Erba Reagents	L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox	Sigma	P4506
protein precipitation solution	QIAGEN	158912
proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308
ribonuclease A	Sigma	R5000
sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625
SPE-C18 (Strata-X)	Phenomenex	8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Carlo Erba Reagents	489983
xylazine	Syntec do Brasil	Commercial name: Xilazin