질량 분 광 법에 의해 3 개의 DNA 병 변의 정량화 및 주변 미세 입자 상 물질에 노출 된 마우스의 조직에서 그들의 수준에 대 한 평가

Summary

우리는 병 변의 민감하고 정확한 정량화를 위한 방법을 여기에 설명 합니다. 8-옥 소-7, 8 디 하이드로 deoxyguanosine),1n6조-2-deoxyadenosine 및1, n6조-2dado deoxyguanosine (1,n2-dguo) DNA에. 이 방법은 노출 된 A/J 마우스의 조직 (폐, 간 및 신장)에서 주변 미세 미 립 자 물질 (PM_2.5)의 영향에 대 한 평가에 적용 되었다.

Abstract

Dna 시드와 및 산화 된 dna 기지는 잔기 되는 물질의 독성 평가를 위한 유용한 생물 표지 자, 생물 변환 시 반응성 전자 기적 생성, 또는 산화 적 스트레스를 유도 하는 dna 병 변의 예이다. 산화 된 핵 염기 중에서 가장 많이 연구 된 것은 DNA에 산화 적으로 유도 된 기본 손상의 바이오 마커로 서 8-옥 소-7, 8 dihydroguanine (8 옥 소 구 아) 또는 8 옥 소 다이-deoxyguanosine. 지질 과산화 과정에서 기인 하는 알 데히드 및에 폭 자일로는 잔기 분자 exocyclic DNA 시드와와 같은 돌연 변이를 형성할 수 있게 되는데,이에 노 다 덕트 1,n2-2-deoxyguanosine εdGuo) 및 염증의병 리 생리학에서의 잠재적 바이오 마커로 서 제안 된 1,n⁶-deoxyadenosine-εdAdo). 세포 돌연변이 속도와 만성 질환 발달 (예: 암, 퇴행 성 신경 질환)을 느리게 하기 위한 예방 전략의 개발에는 DNA에서의 정량화를 위한 선택적이 고 민감한 방법이 필요 합니다. 검출에 사용할 수 있는 민감한 방법 중 (전기 화학적 또는 탠덤 질량 분석 검출기에 결합 된 고성능 액체 크로마토그래피, 혜성 분석 법, 면역 검사 ³²P-포스트 라벨링) 중에서 가장 선택적인 것은 탠덤 질량 분 광 법에 결합 된 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC-ESI/MS). 선택 성은 DNA, 소변, 혈장 및 타 액과 같은 생물학적 매트릭스에서 변형 된 시드의 정량화를 위한 금 표준으로 진화 된 복잡 한 생물학적 샘플 및 HPLC-ESI/MS를 분석할 때 필수적인 장점입니다. 동위 원소 표지 된 내부 표준의 사용은 DNA 가수분해 및 분석 물 농축 단계 동안 분자 손실에 대 한 교정 뿐만 아니라 샘플 간 분석 물질 이온화의 차이에 대 한 보정의 이점을 추가 합니다. 또한, 둘 이상의 피크가 존재할 때 올바른 크로마토그래피 피크를 식별 하는 데 도움이 됩니다.

우리는 여기에 A/J 마우스의 폐, 간 및 신장 DNA에 있는 8 옥 소 오 궈, 1,⁶-다도 및 1,n2의 정량화를 위해 성공적으로 적용 된 민감하고 정확 하 고 정밀한 HPLC-ESI/ms 방법을 제시 합니다 앰비언트 PM_2.5 노출의 효과 평가.

Introduction

일부 반응성 산소 종 (ROS)는 산화 된 염기와 DNA 가닥 나누기를 생성 하는 deoxyribose 모이 어 티의 DNA 염기 및 일부 탄소의 탄소 이중 결합을 산화 할 수 있다¹. 질소 및 산소 원자가 풍부한 음으로 하 전에 분자 인 dna는 dna 시드와²라고 하는 제품을 제공 하는 친 핵 성 사이트 (질소 및 산소)와 공유 적으로 반응 하는 잔기 그룹의 대상 이기도 합니다. 따라서, dna 시드와 및 산화 된 dna 기지는 잔기 물질의 독성 평가를 위한 유용한 바이오 마커로 서, 생물 변환 시 반응성 전기를 생성 하거나, 산화 적 스트레스를 유발 하는 dna 병변의 예입니다. ². 변형 된 DNA 염기가 염기 또는 염기 절제 수리 (BER 또는 NER)에 의해 DNA 로부터 제거 될 수 있지만, dna 병 변의 생성 및 제거 사이에 불균형을 유도 하 여 전자에 찬성 하 여 유전자 초과 근무에서 자신의 수준의 순 증가에 이르게 한다^{3 . 결과는 DNA 변이 율의 증가, 유전자 발현 감소 및 단백질 활성 저하,도4,도6,7등의 효과가 밀접 하 게 관련 되어 있는 질병의 개발. DNA 돌연변이는 세포 신호 전달, 세포 주기, 게놈 완전성, telomere 안정성, 후 성 후 성, 크로마 틴 구조, RNA 스 플라이 싱, 단백질 항상성, 대사 및 세포 분화와 같은 다양 한 세포 기능에 영향을 미칠 수 있다8 ,9. 세포 돌연변이 속도와 만성 질환 발달을 느리게 하는 전략 (예: 암, 신경 퇴행 성 질환)은 그 중 에서도 돌연변이 원의 지식, DNA 병 변 및 그 원인 들을 통과 한다.}

오염 물질 노출, 지속적인 염증, 질병 이상 (예: 당뇨병) 등으로 과잉으로 내 시경 적으로 생성 된 ROS는 DNA 및 지질 손상을 포함 한 생체 분자 손상의 중요 한 원인¹입니다. 일례로 서, 전이 금속 이온 (Fe^{2 +}, Cu⁺)에의 한 고 반응성 수산화 라 디 칼 (OH)이 환 원 되어 형성 된 dna 염기, dna 당 모이 어 티 및 고도 불포화 지방산을 산화 시켜 확산 조절 요금¹⁰. 80 중에서 이미 특성화 된 산화 된 뉴 클레 아 제³중 가장 많이 연구 된 것은 8 옥 소-7, 8-dihydroguanine 및 8 옥 소 다이 deoxyguanosine이 고, 도 1)에서 GT 트랜스 버전을 유도할 수 있는 병 변 포유류 세포^10,11. 구 아닌의 모노 전자 산화에 의해, 또는 DNA¹에서 구 아닌의 하이드 록 실 라 디 칼 또는 일 중 항 산소 공격에 의해 형성 된다. 고도 불포화 지방산은 지질 과산화^1,12의 과정을 시작 하는 ^•OH와 같은 반응성이 높은 산화 제의 다른 중요 한 표적입니다. 이는 malondialdehyde, 4 히 드 록 시 니 알, 잔기 에폭시-데 네 날, 헥 센 날, 아크로 라인, 크로 톤 알 데히드 등의 알 데히드와에 폭 시 알데하이드로 분해 될 수 있는 지방산 하이드로 퍼 옥사이드를 상승 시켜 주며 돌연 변이 exocyclic DNA 시드와 (예: malondialdehyde), propano 또는 etheno 시드와^1,13등을 형성할 수 있습니다. Deoxyguanosine, εdGuo, 그림 1및1, n 6-εdAdo,그림 1의 경우에는이에 대 한 것을 참조 하십시오 (1, 2-2). )는 염증^14,15의 병 리 생리학에서 잠재적인 바이오 마커로 제안 되었다.

그림 1입니다. 본 연구에서 정량화 된 DNA 병 변의 화학 구조. 박사 = 2 ´-deoxyribose. 이 수치는 올리베이라 외³⁴에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

1980 년대 초반에 수행 된 연구는 전기 화학적 검출 (HPLC-ECD)에 결합 된 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 8 옥 소 오 궈의 민감성 검출을 허용 했습니다. 다 수의 생물학적 시스템에서 HPLC-ECD에의 한 8-옥 소 오드의 정량은 산화 성 유도 염기의 바이오 마커로 서 8 옥 소 오 궈의 인정을 받아 DNA^1,16에서 손상 시켰다. 낮은 fmol 범위¹⁷에서 8-옥 소 궈의 정량화를 가능 하 게 하 고 견고 하면서 HPLC-ECD 측정은 분석 물질 식별 및 크로마토그래피 분해능에 대 한 분석 물질 보유 시간의 정확성에 의존 하 여 간섭을 방지 합니다. 다른 샘플 성분. 전기 화학적 검출은 이동 상의 염 분 (예: 인산 칼륨, 아세트산 나트륨)을 사용 해야 하므로 적절 한 분석 조건의 유지 보수에는 일상적인 칼럼 및 장비 세척 시간이 필요 합니다.

대안적으로, 세균 DNA 복구 효소 formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG)를 사용 하 고, 그 후, 인간 8-oxoguanine glycosylase의 검출 및 DNA 로부터 8 옥 소 구 아의 제거를 위한 DNA 알칼리의 유도를 위한 방법으로 등장 사이트. 알칼리 성 불안정 부위는 DNA 가닥 분리로 변환 되어 알칼리 단 세포 겔 전기 영동에의 한 8-옥 소 구 아의 매우 고감도 간접 정량화를 허용 한다 (“혜성 분석 법”). 세포 DNA 추출이 필요 없는 높은 민감도와 분석의 성취는 이러한 유형의 분석의 주요 장점입니다. 이는 DNA에서 가장 낮은 정상 상태 수준을 제공 하며, 일반적으로 HPLC를 기반으로 한 생물학적 분석 방법에 의해 얻어진 수준 보다 7-10 배 낮습니다. 그러나, 8 옥 소 구 아의 간접 측정은 몇 가지 단점이 있고 특이성의 결여 또는 수리 효소의 알려지지 않은 효율이^1,16,18에 사용 된다.

면역 분석은 8-옥 소 구 아¹ 및 exocyclic DNA adducts 등의 검출에 사용 되는 다른 일련의 방법으로, 예를 들어 1,엔⁶-다도 및 1,n2-dado¹². 민감도에도 불구 하 고, dna 병 변의 검출을 위한 항 체의 사용의 단점은 정상적인 dna 염기^1,12를 포함 하는 생물학적 샘플의 다른 성분 들에 대 한 교차 반응성으로 인 한 특이성의 결여 이다. Exocyclic DNA adducts는 1,n2-dado 및 1,n2-dado를 포함 하 여, 또한 고감도 ³²P-포스트 라벨링 분석 법에 의해 검출 되 고 정량화될 수 있다. ³²P-포스트 라벨링의 고감도는 10 개의 정상 염기¹⁹당 약 1 개의 부가 물를 검출 하기 위해 매우 적은 양의 DNA (예를 들어 10 µ g) 를 사용할 수 있게 한다. 그러나, 무선 화학 물질의 사용, 화학적 특이성의 결여 및 낮은 정확도는^19,20의 몇 가지 단점이 있다.

상기 언급 된 방법의 공유 제한은 원하는 분자의 검출을 위한 낮은 선택성 또는 특이성 이다. 이 시나리오에서 전기 분무 이온화 탠덤 질량 분 광 법 (HPLC-ESI-MS/MS 및 HPLC-MS³)에 결합 된 HPLC는 DNA, 소변, 혈장 및 타 액과 같은 생물학적 매트릭스에서 변형 된 시드의 정량화를 위한 금 표준으로 발전 했습니다. ^{1 , 19 , 20}. HPLC-ESI의 장점 (통상적으로 낮은 fmol 범위에서) 및 크로마토그래피 분리에 의해 제공 되는 높은 특이성, ii) 분자의 특성 및 공지 된 패턴이 질량 내부 단편화 및 iii) 다중 반응 모니터링 모드에서 선택 된 질량을 충전 비율 (m/z)에 대 한 정확한 측정이^1,19. 동위 원소 표지 된 내부 표준의 사용은 DNA 가수분해 및 분석 물 농축 단계 동안 분자 손실에 대 한 교정 뿐만 아니라 샘플 간 분석 물질 이온화의 차이에 대 한 보정의 이점을 추가 합니다. 또한^{1개,12,19,20}이상의 피크가 존재할 때 정확한 크로마토그래피 피크를 식별 하는 데 도움을 준다.

HPLC-ESI/ms에 기초한 몇 가지 방법은 상이한 생물학적 샘플 로부터 추출 된 8 옥 소 오 궈, 1,엔⁶-다도 및 1,n2-dado의 정량 분석을 위해 사용 되었다^12,20 ,²¹,²⁶,²⁷,²⁸,²⁹ . 미 립 자 (PM_2.5)는 염증을 유도할 수 있는 다 환 방향족 탄화수소 (pahs), 니트로 pahs, 알 데히드, 케 톤, 카 르 복 실 산, 퀴 놀 린, 금속 및 수용 성 이온과 같은 유기 및 무기 화학 물질을 운반 합니다. 산화 적 스트레스, 생체 분자 손상 및 질병의 발생을 선호 하는 조건³⁰,^31,32,33. 이 하, 본 원에 대 한 평가를 위하여 A/J 마우스의 폐, 간 및 신장 DNA에 8-옥 소 오그의 정량화를 위해 성공적으로 적용된 HPLC-ESI/ms 방법에 대 한 검증을 실시 하 고 있습니다. 앰비언트 PM_2.5 노출³⁴의 효과.

Protocol

4 주 늙은 남성 A/J 마우스, 특정 병원 체 무료, 우 다 카오 Oswaldo 크루즈 (FIOCRUZ), 브라질 리오 데 자네이로의 실험실 동물의 사육 센터에서 얻어 졌다 고 의학 학부의 윤리 위원회에 따라 처리 하였다, 대학 (프로토콜 no 1310/09). 1. 생쥐 조직의 수집 동물에 게 xylazine 및 케 타 민를 마 취 시켰다. 체중 30g의 마우스의 경우, 케 타 민 및 복 강 내의 자일 라 딘 0.38 mg을 ?…

Representative Results

마우스 간에 서 얻어진 평균 DNA 농도 (±sd), 폐 (~ 0.2 g 조직) 및 신장 (~ 0.4 g 조직)은 각각 5068 ± 2615, 4369 ± 1021 및 3223 ± 723 µ µ L의 최종 부피로 하였다. 정제 된 DNA의 HPLC-DAD에 의해 얻어진 대표적인 크로마 토 그램을 도 3에 나타내 었 다. 해당 2 ‘-deoxynucleosides 직전에 용 리 RNA ribonucleosides에서 자유로운 4 개의 2 ‘-deoxynucleosides의 존재는 DNA 순수성을 보여?…

Discussion

HPLC 방법에의 한 8-옥 시 오드 구 오 분석에서 발견 되는 주요 문제점은 dna 추출, dna 가수분해 및 dna 가수분해 물의 농축 과정 중에 그 형성의 유도가^22,38이다. 8-옥 시 오 스의 아 티 사실 형성의 문제를 최소화 하기 위하여, 모든 DNA 추출, 저장 및 가수분해 용액에 지연 소 아민을 첨가 하는 것이 좋으며,이는 요오드 화 나트륨의 사용과 DNA 추출 시 페 놀의 …

Materials

[15N5]-2’-deoxyadenosine	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-3899-CA-10
acetonitrile	Carlo Erba Reagents	412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa	Sigma	P5521
ammonium acetate	Merck	101116
calf thymus DNA	Sigma	D1501
cell lysis solution	QIAGEN	158908
chloroform	Carlo Erba Reagents	412653
deferoxamine	Sigma	D9533
deoxyribonuclease I (DNase I)	Bio Basic Inc	DD0649
ethanol	Carlo Erba Reagents	414542
formic acid	Sigma-Aldrich	F0507
HPLC-ESI-MS/MS system	HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments	HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system	Shimadzu	Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18)	Phenomenex	00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18)	Phenomenex	00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18)	Phenomenex	00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)	Phenomenex	AJO-4287
isoamyl alcohol	Sigma-Aldrich	M32658
isopropyl alcohol (isopropanol)	Carlo Erba Reagents	A412790010
ketamine	Ceva	Commercial name: Dopalen
magnesium chloride	Carlo Erba Reagents	349377
magnesium chloride	Sigma	M2393
methanol	Carlo Erba Reagents	L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox	Sigma	P4506
protein precipitation solution	QIAGEN	158912
proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308
ribonuclease A	Sigma	R5000
sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625
SPE-C18 (Strata-X)	Phenomenex	8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Carlo Erba Reagents	489983
xylazine	Syntec do Brasil	Commercial name: Xilazin