Amputation og regenerering af voksent muse ciffer: en simpel model til undersøgelse af dannelsen af pattedyrs blastema og Intramembranøs ossifikation
Summary
Her præsenterer vi en protokol af voksne mus Terminal falanks amputation at undersøge pattedyrs tema dannelse og Intramembranous ossifikation, analyseret af fluorescerende Immunhistokemi og sekventiel in vivo mikrocomputer tomografi.
Abstract
Her præsenterer vi en protokol af voksne mus distale Terminal falanks (P3) amputation, en proceduremæssigt enkel og reproducerbar pattedyrs model af epimorphic regenerering, som involverer tema dannelse og Intramembranous ossifikation analyseret af Fluorescens Immunhistokemi og sekventiel in vivo-mikrocomputer tomografi (μCT). Regenerering af pattedyr er begrænset til amputationer, der transektere den distale region af terminalen falanks (P3); cifre amputeret på mere proksimale niveauer undlader at regenerere og gennemgå fibrotisk helbredelse og ardannelse. Regenererings reaktionen medieres ved dannelsen af en proliferativ blastema, efterfulgt af knogle regenerering via intramembranøs ossifikation for at genoprette den amputerede skelet længde. P3 amputation er en præklinisk model til at undersøge epimorphic regenerering i pattedyr, og er et effektivt værktøj til design af terapeutiske strategier til at erstatte fibrotisk helbredelse med en vellykket regenerativ respons. Vores protokol bruger fluorescens Immunhistokemi til 1) identificere tidlige-og-sene tema cellepopulationer, 2) undersøgelse revaskularisering i forbindelse med regenerering, og 3) undersøge Intramembranous ossifikation uden behov for komplekse knogle stabiliseringsanordninger. Vi viser også brugen af sekventiel in vivo μCT til at skabe billeder i høj opløsning til at undersøge morfologiske ændringer efter amputation, samt kvantificere volumen-og længde ændringer i det samme ciffer i løbet af regenerering. Vi mener, at denne protokol tilbyder enorm nytte til at undersøge både epimorphic og vævs regenerativ reaktioner i pattedyr.
Introduction
Pattedyr, herunder mennesker og mus, har kapacitet til at regenerere spidserne af deres cifre efter distale amputation af terminalen falanks (P3)1,2,3. I mus er regenererings reaktionen amputation-niveau afhængig; stadigt mere proksimale talamputationer viser et progressivt svækket regenerativ respons, indtil komplet regenerativ fejl ved amputationer transekting og proksimalt til P3-negle matrixen4,5,6 , 7 , 8. P3-regenerering medieres ved dannelsen af en blastema, defineret som en population af prolifererende celler, der gennemgår morfogenese for at regenerere de amputerede strukturer9. Dannelsen af en tema for at regenerere de strukturer, der er gået tabt ved amputation, en proces, som kaldes epimorphic regenerering, adskiller P3-regenererings reaktionen på flere vævs niveauer fra traditionel vævsreparation efter skade6, 10. P3-regenerering er en reproducerbar og proceduremæssigt enkel model til undersøgelse af komplekse regenerativ processer, herunder sårheling11,12, knogle histolyse11,12, revaskularisering13, perifer nerve Regeneration14, og blastemal omdannelse til knogle via intramembranøs ossifikation15.
Tidligere studier med immun histokemi har vist, at tema er heterogent, Avaskulær, hypoxisk og meget proliferativ11,13,15,16. Efter distale P3-amputation er den tidlige tema i første omgang associeret med P3 periosteum og som og er karakteriseret ved robust proliferation og spirende osteogenese ved siden af knogleoverfladen15. Efter knoglenedbrydning og sårlukning dannes heterogene tema ved sammensmeltningen af periost-og endosteal-associerede celler, efterfulgt af differentieringen af blastemale komponenter, herunder knogle via intramembranøs ossifikation 15.
Knogle reparation som reaktion på skade opstår typisk ved endokondral ossifikation, dvs. via en indledende brusk, der danner en skabelon for efterfølgende knogledannelse17,18. Lang knogle Intramembranous ossifikation, dvs, knogledannelse uden en brusk mellemliggende, er almindeligt induceret ved hjælp af komplekse distraktion anordninger eller kirurgisk fiksering19,20. Det ciffer regenererende respons er en præklinisk model, der giver fordele i forhold til konventionelle intramembranske ossifikation modeller: 1) det kræver ikke ekstern eller intern fiksering post skade at stimulere Intramembranous ossifikation, 2) det er udført ved hjælp af 4 cifre fra hvert dyr, og dermed maksimere prøver, mens minimere dyrs brug, og 3) sekventiel in vivo mikrocomputer tomografi (μCT) analyse kan udføres med lethed og hastighed.
I denne undersøgelse viser vi det standardiserede P3-amputerings plan for at opnå et reproducerbart og robust regenererings respons. Derudover demonstrerer vi en optimeret fluorescens immunhistokemisk protokol ved hjælp af paraffin sektioner for at visualisere tema dannelse, revaskularisering i forbindelse med regenerering og blastemal omdannelse til knogle via Intramembranous Ossifikation. Vi viser også brugen af sekventiel in vivo μCT til at identificere ændringer i knogle morfologi, volumen og længde i det samme ciffer i løbet af regenerering. Formålet med denne protokol er at undersøge dannelsen af pattedyr tema efter amputation og at påvise 2 teknikker, fluorescens Immunhistokemi og sekventiel in vivo μct, til studiet af intramembranøs knogle regenerering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en standardiseret procedure for voksne mus distale P3 amputation, fluorescerende immun Histokemisk farvning til at visualisere og undersøge tema dannelse og Intramembranous ossifikation, og sekventiel in vivo μct scanning til Identificer knogle morfologiske, volumen og længde ændringer post amputation. P3 amputation er en unik, proceduremæssigt enkel og reproducerbar model til at analysere et Pro-regenerativ sårmiljø, der udløser tema dannelse. Desuden giver P3-cifret model talrige fordel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmerne af Muneoka Lab og Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Dette arbejde blev støttet af Texas A & M University.
Materials
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
Referências
- Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
- Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
- Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
- Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
- Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Biologia do Desenvolvimento. 315, 125-135 (2008).
- Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
- Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
- Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
- Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. Biologia do Desenvolvimento. 433, 190-199 (2018).
- Carlson, B. M. . Principles of Regenerative Biology. , (2007).
- Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. Biologia do Desenvolvimento. 350, 301-310 (2011).
- Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
- Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
- Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. Biologia do Desenvolvimento. 445, 237-244 (2018).
- Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
- Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
- Einhorn, T. A. The science of fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).
- Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
- Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
- Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. Biologia do Desenvolvimento. 382, 98-109 (2013).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).
