Volwassen muis cijfer amputatie en regeneratie: een eenvoudig model om de vorming en Intramembraneuze ossificatie van zoogdier Blastema te onderzoeken
Summary
Hier presenteren we een protocol van volwassen muizen Terminal falalanx amputatie om de vorming van zoogdieren blastema en intramembraneuze ossificatie te onderzoeken, geanalyseerd door fluorescerende immunohistochemie en sequentiële in-vivo microcomputer tomografie.
Abstract
Hier presenteren we een protocol van volwassen muizen distale terminale falanx (P3) amputatie, een procedureel eenvoudig en reproduceerbaar zoogdier model van epimorfe regeneratie, dat blastema-vorming en intramembraneuze ossificatie omvat, geanalyseerd door fluorescentie immunohistochemie en sequentiële in-vivo microcomputer tomografie (μCT). De zoogdier regeneratie is beperkt tot amputaties die het distale gebied van de terminale falanx (P3) dwars doorkruisen; cijfers geampuleerd op meer proximale niveaus niet te regenereren en ondergaan fibrotische genezing en littekenvorming. De regeneratie respons wordt gemedieerd door de vorming van een proliferatieve blastema, gevolgd door botregeneratie via intramembraneuze ossificatie om de geampuleerde skelet lengte te herstellen. P3 amputatie is een preklinisch model om epimorfe regeneratie bij zoogdieren te onderzoeken, en is een krachtig hulpmiddel voor het ontwerpen van therapeutische strategieën om fibrotische genezing te vervangen door een succesvolle regeneratieve respons. Ons protocol maakt gebruik van fluorescentie immunohistochemie op 1) Identificeer vroege en late blastema celpopulaties, 2) Bestudeer revascularisatie in de context van regeneratie, en 3) onderzoek intramembraneuze ossificatie zonder de noodzaak van complexe botten stabilisatie apparaten. We demonstreren ook het gebruik van sequentiële in-vivo μCT om afbeeldingen met een hoge resolutie te maken om morfologische veranderingen na amputatie te onderzoeken, en om volume-en lengte veranderingen in hetzelfde cijfer te kwantificeren tijdens de regeneratie. Wij geloven dat dit protocol een enorm nut biedt om zowel epimorfe als weefsel regeneratieve reacties bij zoogdieren te onderzoeken.
Introduction
Zoogdieren, met inbegrip van mensen en muizen, hebben de capaciteit om de toppen van hun cijfers te regenereren na distale amputatie van de Terminal falanx (P3)1,2,3. Bij muizen is de regeneratie reactie amputatie-niveau afhankelijk; in toenemende mate van proximale cijfers wordt een geleidelijk verzwakte regeneratieve respons weergegeven totdat volledig regeneratief falen bij amputaties Romeinse en proximale naar de P3-nagel matrix4,5,6 , 7 , 8. P3-regeneratie wordt gemedieerd door de vorming van een blastema, gedefinieerd als een populatie van prolifererende cellen die morfogenese ondergaan om de geampuleerde structuren te regenereren9. De vorming van een blastema om de door amputatie verloren structuren te regenereren, een proces dat epimorfe regeneratie wordt genoemd, onderscheidt de P3-regeneratie respons op multi weefselniveau van de traditionele weefselherstel na blessure6, 10. P3-regeneratie is een reproduceerbaar en procedureel eenvoudig model om complexe regeneratieve processen te onderzoeken, waaronder wondgenezing11,12, bot histolysis11,12, revascularisatie13, perifere zenuw regeneratie14, en blastemal conversie naar bot via intramembraneuze ossificatie15.
Uit eerdere studies met immunohistochemie is gebleken dat de blastema heterogeen, avasculair, hypoxisch en zeer proliferatief is11,13,15,16. Na de distale P3-amputatie wordt de vroege blastema in eerste instantie geassocieerd met het P3-periosteum en endosteum en wordt gekenmerkt door een robuuste proliferatie en ontluikende osteogenese grenzend aan het botoppervlak15. Na botdegradatie en wondsluiting wordt de heterogene blastema gevormd door het samenvoegen van periostehoudende en endosteal geassocieerde cellen, gevolgd door de differentiatie van blastemale componenten, waaronder bot via intramembraneuze ossificatie 15.
Botreparatie in reactie op letsel treedt meestal op door endochondrale ossificatie, d.w.z. via een initiële kraakbeenachtige Callus die een sjabloon vormt voor daaropvolgende botvorming17,18. Lange botintramembraneuze ossificatie, d.w.z. botvorming zonder kraakbeen middel, wordt vaak geïnduceerd met behulp van complexe afleid inrichtingen of chirurgische fixatie19,20. De Digit-regeneratie respons is een preklinisch model dat voordelen biedt ten opzichte van conventionele intramembraneuze ossificatie modellen: 1) het vereist geen externe of interne fixatie post letsel om intramembraneuze ossificatie te stimuleren, 2) het is uitgevoerd met 4 cijfers van elk dier, waardoor monsters worden gemaximaliseerd terwijl het dier gebruik wordt geminimaliseerd, en 3) sequentiële in vivo microcomputer tomografie (μCT) analyse kan met gemak en snelheid worden uitgevoerd.
In de huidige studie tonen we het gestandaardiseerde P3-amputatie vlak om een reproduceerbare en robuuste regeneratie respons te bereiken. Daarnaast demonstreren we een geoptimaliseerd fluorescentie immunohistochemie protocol met behulp van paraffine secties om de vorming van blastema, revascularisatie in de context van regeneratie en de blastemal conversie naar het bot via intramembraneuze ossificatie. We demonstreren ook het gebruik van sequentieel in-vivo μCT om veranderingen in botmorfologie, volume en lengte in hetzelfde cijfer te identificeren in het verloop van de regeneratie. Het doel van dit protocol is om de vorming van zoogdieren blastema na amputatie te onderzoeken en om 2 technieken, fluorescentie immunohistochemie en sequentieel in vivo μCT te demonstreren, voor de studie van intramembraneuze botregeneratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde procedure van volwassen muis distale P3 amputatie, fluorescerende immunohistochemische kleuring om blastema vorming en intramembraneuze ossificatie te visualiseren en te onderzoeken, en sequentieel in-vivo μCT scanning om Identificeer botmorfologische, volume-en lengte wijzigingen na amputatie. P3-amputatie is een uniek, procedureel eenvoudig en reproduceerbaar model om een Pro-regeneratieve wondomgeving te analyseren die blastema-vorming activeert. Bovendien biedt het P3-c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van het Muneoka Lab en het Texas Institute for genomic Medicine (TIGM). Dit werk werd gesteund door Texas A & M University.
Materials
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
Referências
- Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
- Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
- Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
- Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
- Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Biologia do Desenvolvimento. 315, 125-135 (2008).
- Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
- Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
- Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
- Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. Biologia do Desenvolvimento. 433, 190-199 (2018).
- Carlson, B. M. . Principles of Regenerative Biology. , (2007).
- Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. Biologia do Desenvolvimento. 350, 301-310 (2011).
- Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
- Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
- Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. Biologia do Desenvolvimento. 445, 237-244 (2018).
- Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
- Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
- Einhorn, T. A. The science of fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).
- Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
- Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
- Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. Biologia do Desenvolvimento. 382, 98-109 (2013).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).
