Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll der erwachsenen Maus-Terminal-Phalanx-Amputation vor, um die Explosion von Säugetieren und die intramembranöse Ossifikation zu untersuchen, die durch fluoreszierende Immunhistochemie und sequenzielle In-vivo-Mikrocomputertomographie analysiert wird.
Abstract
Hier stellen wir ein Protokoll der distalen Terminalphalanx (P3) amputation für Erwachsene vor, ein verfahrenstechnisch einfaches und reproduzierbares Säugetiermodell der epimorphen Regeneration, das die Blastemabildung und die intramembranöse Ossifikation umfasst, die von Fluoreszenz-Immunhistochemie und sequenzielle In-vivo-Mikrocomputertomographie (CT). Die Regeneration der Säugetiere beschränkt sich auf Amputationen, die den distalen Bereich der Terminalphalanx (P3) transsektieren; Ziffern, die auf proximaleren Ebenen amputiert werden, können sich nicht regenerieren und werden fibrotisch geheilt und narbt gebildet. Die Regenerationsreaktion wird durch die Bildung eines proliferativen Blastema summiert, gefolgt von knochenregeneration durch intramembranöse Verknöcherung, um die amputierte Skelettlänge wiederherzustellen. P3-Amputation ist ein präklinisches Modell zur Untersuchung der epimorphen Regeneration bei Säugetieren und ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Entwicklung therapeutischer Strategien, um fibrotische Heilung durch eine erfolgreiche regenerative Reaktion zu ersetzen. Unser Protokoll verwendet Fluoreszenz-Immunhistochemie, um 1) früh- und späte Blastemzellpopulationen zu identifizieren, 2) Revaskularisation im Zusammenhang mit der Regeneration zu untersuchen und 3) die intramembranöse Verknöcherung ohne komplexe Knochen zu untersuchen Stabilisierungsvorrichtungen. Wir zeigen auch die Verwendung von sequenziellem in vivo -CT, um hochauflösende Bilder zu erstellen, um morphologische Veränderungen nach der Amputation zu untersuchen sowie Volumen- und Längenänderungen in derselben Ziffer im Verlauf der Regeneration zu quantifizieren. Wir glauben, dass dieses Protokoll einen enormen Nutzen bietet, um sowohl epimorphe als auch geweberegenerierende Reaktionen bei Säugetieren zu untersuchen.
Introduction
Säugetiere, einschließlich Menschen und Mäuse, haben die Fähigkeit, die Spitzen ihrer Ziffern nach distaler Amputation der Terminalphalanx (P3)1,2,3zu regenerieren. Bei Mäusen ist die Regenerationsreaktion amputationsniveauabhängig; zunehmend proximale Ziffernamputationen zeigen eine zunehmend abgeschwächte regenerative Reaktion bis zum vollständigen regenerativen Versagen bei Amputationen, die sich überschneiden, und proximal zur P3-Nagelmatrix4,5,6 , 7 , 8. Die P3-Regeneration wird durch die Bildung eines Blastema vermittelt, definiert als eine Population von sich ausbreitenden Zellen, die einer Morphogenese unterzogen werden, um die amputierten Strukturen zu regenerieren9. Die Bildung eines Blastema zur Regeneration der durch Amputation verlorenen Strukturen, ein Prozess, der als epimorphe Regeneration bezeichnet wird, unterscheidet die Multi-Gewebe-Level-P3-Regenerationsreaktion von der traditionellen Gewebereparatur nach Verletzung6, 10. P3 Regeneration ist ein reproduzierbares und verfahrenstechnisch einfaches Modell zur Untersuchung komplexer regenerativer Prozesse einschließlich Wundheilung11,12, Knochenhistolyse11,12, Revaskularisation13, periphere Nervenregeneration14, und blastemale Umwandlung in Knochen über intramembranöse Ossifikation15.
Frühere Studien mit Immunhistochemie haben gezeigt, dass das Blastema heterogen, avaskulär, hypoxisch und hoch proliferativ11,13,15,16ist. Nach distaler P3-Amputation wird das frühe Blastema zunächst mit dem P3-Periost und Endosteum assoziiert und zeichnet sich durch eine robuste Proliferation und aufkeimende Osteogenese neben der Knochenoberfläche15aus. Nach Knochenabbau und Wundverschluss wird das heterogene Blastema durch die Verschmelzung von periostealen und endostealassoziierten Zellen gebildet, gefolgt von der Differenzierung von blastemalen Komponenten einschließlich Knochen durch intramembranöse Verknöcherung 15.
Knochenreparatur als Reaktion auf Verletzungen tritt typischerweise durch endochondrale Verknöcherung auf, d.h. über einen ersten knorpelförmigen Callus, der eine Vorlage für die nachfolgende Knochenbildung bildet17,18. Die intramembranöse Verknöcherung des langen Knochens, d.h. die Knochenbildung ohne knorpelförmiges Zwischenprodukt, wird häufig mit komplexen Ablenkungsvorrichtungen oder chirurgischer Fixierunginduziert 19,20. Das Ziffernregenerationsverhalten ist ein präklinisches Modell, das Vorteile gegenüber herkömmlichen intramembranösen Verknöcherungsmodellen bietet: 1) es erfordert keine externe oder interne Fixierung nach verletzungen, um die intramembranöse Ossifikation zu stimulieren, 2) mit 4 Ziffern von jedem Tier durchgeführt, wodurch Proben bei gleichzeitiger Minimierung des Einsatzes von Tieren maximiert werden, und 3) sequentielle In-vivo-Mikrocomputertomographie-Analysen (CT) können mit Leichtigkeit und Geschwindigkeit durchgeführt werden.
In der vorliegenden Studie zeigen wir die standardisierte P3-Amputationsebene, um eine reproduzierbare und robuste Regenerationsreaktion zu erreichen. Zusätzlich zeigen wir ein optimiertes Fluoreszenz-Immunhistochemieprotokoll mit Paraffinabschnitten zur Visualisierung der Blastemabildung, Revaskularisation im Kontext der Regeneration und blastemalen Umwandlung in Knochen über intramembranöse Ossifikation. Wir zeigen auch die Verwendung von sequenziellem In-vivo-CT, um Veränderungen in der Knochenmorphologie, Volumen und Länge in der gleichen Ziffer im Laufe der Regeneration zu identifizieren. Ziel dieses Protokolls ist es, die Explosion bildung von Säugetieren nach der Amputation zu untersuchen und zwei Techniken, die Fluoreszenzimmunhistochemie und die sequenzielle in vivo-CT, zur Untersuchung der intramembranösen Knochenregeneration zu demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein standardisiertes Verfahren der distalen P3-Amputation von Erwachsenenmäusen, fluoreszierende immunhistochemische Färbung zur Visualisierung und Untersuchung der Blastembildung und intramembranösen Verknöcherung sowie Knochenmorphologie, Volumen und Längenänderungen nach der Amputation zu identifizieren. P3-Amputation ist ein einzigartiges, prozedural einfaches und reproduzierbares Modell zur Analyse einer pro-regenerativen Wundumgebung, die die Blastemabildung auslöst. Darüber hina…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mitgliedern des Muneoka Lab und des Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Diese Arbeit wurde von der Texas A&M University unterstützt.
Materials
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
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