वयस्क माउस अंक विच्छेदन और पुनर्जनन: एक सरल मॉडल मैमलियन Blastema गठन और Intramembranous Ossification की जांच करने के लिए
Summary
यहाँ, हम वयस्क माउस टर्मिनल phalanx विच्छेदन का एक प्रोटोकॉल पेश करने के लिए स्तनधारी blastema गठन और intramembranous ossification की जांच, फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और अनुक्रमिक में-vivo microcomputed टोमोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया.
Abstract
यहाँ, हम वयस्क माउस distal टर्मिनल phalanx (P3) विच्छेदन, एक प्रक्रियात्मक सरल और epimorphic पुनर्जनन के reproducible स्तनधारी मॉडल है, जो blastema गठन और intramembranous ossification द्वारा विश्लेषण शामिल है की एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और अनुक्रमिक इन-विवो माइक्रोकम्प्यूटेड टोमोग्राफी (जेडसीटी)। मैमली पुनर्जनन टर्मिनल phalanx (P3) के distal क्षेत्र transecting विच्छेदन के लिए प्रतिबंधित है; अधिक समीपस्थ स्तर पर विच्छेदन किए गए अंक फाइब्रोटिक उपचार और निशान गठन से गुजरना करने में विफल रहते हैं। पुनर्जनन प्रतिक्रिया एक proliferative blastema के गठन के द्वारा मध्यस्थता की है, इसके बाद हड्डी पुनर्जनन के माध्यम से intrembranous ossification के लिए विच्छेदन कंकाल लंबाई बहाल करने के द्वारा. P3 विच्छेदन स्तनधारियों में epimorphic पुनर्जनन की जांच करने के लिए एक पूर्व नैदानिक मॉडल है, और एक सफल पुनर्योजी प्रतिक्रिया के साथ फाइब्रोटिक चिकित्सा की जगह चिकित्सीय रणनीतियों के डिजाइन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. हमारे प्रोटोकॉल के लिए फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करता है 1) जल्दी और लेट blastema सेल आबादी की पहचान, 2) अध्ययन पुनर्जनन के संदर्भ में revascularization, और 3) जटिल हड्डी के लिए आवश्यकता के बिना intramembranous ossification की जांच स्थिरीकरण उपकरणों. हम विच्छेदन के बाद आकृतिक परिवर्तनों की जांच करने के लिए उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को बनाने के लिए विवो में अनुक्रमिक के उपयोग के साथ-साथ पुनर्जनन के दौरान एक ही अंक में मात्रा और लंबाई में परिवर्तन भी प्रदर्शित करते हैं। हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल दोनों epimorphic और स्तनधारियों में ऊतक पुनर्योजी प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए जबरदस्त उपयोगिता प्रदान करता है.
Introduction
मानव और चूहों सहित स्तन, टर्मिनल phalanx (P3)1,2,3के विच्छेदन के बाद अपने अंकों के सुझावों को पुनर्जीवित करने की क्षमता है। चूहों में, पुनर्जनन प्रतिक्रिया विच्छेदन स्तर पर निर्भर है; तेजी से समीपस्थ अंक विच्छेदन एक उत्तरोत्तर क्षीण पुनर्योजी प्रतिक्रिया प्रदर्शित जब तक विच्छेदन transecting पर पूर्ण पुनर्योजी विफलता और P3 नाखून मैट्रिक्स4,5,6 के लिए निकट , 7 , 8. च3 पुनर्जनन एक ब्लास्टेमा के गठन से मध्यस्थता की जाती है, जिसे अपादान कोशिकाओं की जनसंख्या के रूप में परिभाषित किया जाता है जो विच्छेदनसंरचनाओं को पुनर्जीवित करने के लिए रूपजनन से गुजरती हैं9. विच्छेदन से खो संरचनाओं को पुनर्जीवित करने के लिए एक blastema के गठन, एक प्रक्रिया epimorphic पुनर्जनन कहा जाता है, चोट6के बाद पारंपरिक ऊतक की मरम्मत से बहु ऊतक स्तर पी 3 पुनर्जनन प्रतिक्रिया भेद, 10पी 3 पुनर्जनन एक पुनरुज्जीवन है जो घाव भरने वाले11,12, हड्डी हिस्टोलिसिस11,12, सहित जटिल पुनर्योजी प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक पुनरुत्पादक और प्रक्रियात्मक सरल मॉडल है , पुनर्संवक्षण13, परिधीय तंत्रिका पुनर्जनन14, और ब्लास्टेमल रूपांतरण अस्थि के माध्यम से अंतर्विष् ट अस्थि 15 .
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करने वाले पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ब्लास्टेमा विषमांगी , अवास्कुलर , हाइपोक्सिक और अत्यधिक प्रसारी11,13,15,16है . दूरस्थ पी 3 विच्छेदन के बाद, जल्दी blastema शुरू में P3 periosteum और endosteum के साथ जुड़ा हुआ है और मजबूत प्रसार और हड्डी की सतह15के निकट नवजात अस्थिजनन की विशेषता है. हड्डी गिरावट और घाव बंद करने के बाद, विषम ब्लास्टेमा पेरिओस्टल और एंडोस्टील-संबद्ध कोशिकाओं के विलय से बनता है, इसके बाद अंतर्जातीय अस्थि के माध्यम से हड्डी सहित ब्लास्टेमल घटकों के विभेदन के बाद 15.
चोट के जवाब में हड्डी की मरम्मत आम तौर पर endochondral ossification द्वारा होता है, यानी एक प्रारंभिक उपास्थि कॉलस के माध्यम से कि बाद में हड्डी गठन के लिए एक टेम्पलेट रूपों17,18. लंबी हड्डी intramembranous ossification, अर्थात्, एक उपास्थि मध्यवर्ती बिना हड्डी गठन, आमतौर पर जटिल व्याकुलता उपकरणों या शल्य निर्धारण का उपयोग कर प्रेरित है19,20. अंक पुनर्जनन प्रतिक्रिया एक पूर्व नैदानिक मॉडल है कि पारंपरिक intramembranous ossification मॉडल पर लाभ प्रदान करता है: 1) यह बाहरी या आंतरिक निर्धारण पोस्ट चोट की आवश्यकता नहीं है intramembranous ossification को प्रोत्साहित करने के लिए, 2) यह है प्रत्येक जानवर से 4 अंक का उपयोग कर प्रदर्शन किया, इस प्रकार नमूनों को अधिकतम करते हुए पशु उपयोग को कम करने, और 3) विवो microcomputed टोमोग्राफी में अनुक्रमिक (जेडसीटी) विश्लेषण आसानी और गति के साथ किया जा सकता है।
वर्तमान अध्ययन में, हम मानकीकृत P3 विच्छेदन विमान दिखाने के लिए एक reproduible और मजबूत पुनर्जनन प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए. इसके अतिरिक्त, हम ब्लास्टेमा गठन की कल्पना करने के लिए पैराफिन वर्गों का उपयोग करके एक अनुकूलित फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं, पुनर्जनन के संदर्भ में पुनर्संवहनीकरण, और अंतर्जातीय के माध्यम से हड्डी में ब्लास्टेमल रूपांतरण अस्थिकरण. हम भी पुनर्जनन के पाठ्यक्रम पर एक ही अंक में हड्डी आकृति विज्ञान, मात्रा, और लंबाई में परिवर्तन की पहचान करने के लिए अनुक्रमिक में विवो जेडसीटी का उपयोग प्रदर्शित करता है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य विच्छेदन के बाद स्तनधारी blastema गठन की जांच करने के लिए और 2 तकनीकों, फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और विवो जेडसीटी में अनुक्रमिक प्रदर्शन करने के लिए है, intramembranous हड्डी पुनर्जनन के अध्ययन के लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल वयस्क माउस distal P3 विच्छेदन की एक मानकीकृत प्रक्रिया का वर्णन करता है, फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला कल्पना और blastema गठन और intramembranous ossification की जांच करने के लिए, और अनुक्रमिक में-vivo ]CT स्कैनिं?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Muneoka लैब और जीनोमिक चिकित्सा के लिए टेक्सास संस्थान (TIGM) के सदस्यों को धन्यवाद. यह काम टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
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