Amputazione e rigenerazione delle cifre del mouse adulto: un modello semplice per indagare sulla formazione del Blastema mammario e sull'ossificazione intramembranosa

Summary

Qui, presentiamo un protocollo di amputazione della falange terminale dei topi adulti per studiare la formazione di blastema mammifero e l’ossificazione intramembranosa, analizzata dall’immunohistochimica fluorescente e dalla tomografia microcalcolata in vivo sequenziale.

Abstract

Qui, presentiamo un protocollo di amputazione terminale distale distale adulto (P3), un modello di mammifero procedurale semplice e riproducibile di rigenerazione epimorfica, che coinvolge la formazione di blastema e l’ossificazione intramembrana analizzata da immunohistochimica a fluorescenza e tomografia microcalcolata in vivo sequenziale (CT). La rigenerazione dei mammiferi è limitata alle amputazioni che trasmettono la regione distale della falange terminale (P3); le cifre amputate a livelli più prossimali non riescono a rigenerare e a subire la guarigione fibrotica e la formazione di cicatrici. La risposta di rigenerazione è mediata dalla formazione di un blastema proliferante, seguita dalla rigenerazione ossea tramite ossificazione intramembranosa per ripristinare la lunghezza scheletrica amputata. L’amputazione P3 è un modello preclinico per studiare la rigenerazione epimorfica nei mammiferi ed è un potente strumento per la progettazione di strategie terapeutiche per sostituire la guarigione fibrotica con una risposta rigenerativa di successo. Il nostro protocollo utilizza l’immunohistochimica a fluorescenza a 1) identificare le popolazioni di cellule di blastema precoce e tardiva, 2) studiare la rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione, e 3) studiare l’ossificazione intramembranosa senza la necessità di ossa complesse dispositivi di stabilizzazione. Dimostriamo anche l’uso di immagini sequenziali in vivo per creare immagini ad alta risoluzione per esaminare i cambiamenti morfologici dopo l’amputazione, nonché quantificare i cambiamenti di volume e lunghezza nella stessa cifra nel corso della rigenerazione. Crediamo che questo protocollo offra un’enorme utilità per studiare le risposte epimorfiche e rigenerative dei tessuti nei mammiferi.

Introduction

I mammiferi, compresi gli esseri umani e i topi, hanno la capacità di rigenerare le punte delle loro cifre dopo l’amputazione distale della falange terminale (P3)^1,2^,3. Nei topi, la risposta di rigenerazione è dipendente dal livello di amputazione; amputazioni a cifre sempre più prossimal mostrano una risposta rigenerativa progressivamente attenuata fino al completo fallimento rigenerativo alle amputazioni che trasmettono e proximal alla matrice di unghie P3^{4,5,6 , 7} (in questo stato ^{, 8}. La rigenerazione P3 è mediata dalla formazione di un blastema, definito come una popolazione di cellule proliferanti che subiscono la morfogenesi per rigenerare le strutture amputate⁹. La formazione di un blastema per rigenerare le strutture perse dall’amputazione, un processo chiamato rigenerazione epimorfica, distingue la risposta di rigenerazione P3 multi-livello tissutale dalla riparazione tradizionale dei tessuti dopo la lesione^{6, 10.}La rigenerazione P3 è un modello riproducibile e procedurale semplice per studiare complessi processi rigenerativi tra cui la guarigione delle ferite^11,12, istolisi ossea^11,12, vascellizzazione¹³, rigenerazione del nervo periferico¹⁴, e conversione blastemica in osso tramite ossificazione intramembranosa¹⁵.

Studi precedenti che utilizzano l’immunosintochimica hanno dimostrato che il blastema è eterogeneo, avascolare, ipossico e altamente proliferante^11,13,15,16. A seguito dell’amputazione dissatsale del P3, il blastema primitivo è inizialmente associato al periosteo P3 e all’endosteo ed è caratterizzato da una robusta proliferazione e osteogenesi nascente adiacente alla superficie ossea¹⁵. Dopo la degradazione ossea e la chiusura della ferita, il blastema eterogeneo è formato dalla fusione di cellule associate al periosteal ed endosteal, seguito dalla differenziazione dei componenti blastemale, tra cui l’osso attraverso l’ossificazione ^{intramembrana 15}.

La riparazione ossea in risposta a lesioni avviene tipicamente per ossificazione endocondrale, cioè tramite un callo cartilagineo iniziale che forma un modello per la successiva formazione ossea^17,18. L’ossificazione intramembranosa dell’osso lungo, cioè la formazione ossea senza un intermedio cartilagineo, è comunemente indotta utilizzando complessi dispositivi di distrazione o fissazione chirurgica^19,20. La risposta alla rigenerazione numerica è un modello preclinico che offre vantaggi rispetto ai modelli convenzionali di osssificazione intramembranous: 1) non richiede lesioni post post di fissaggio esterne o interne per stimolare l’ossificazione intramembrana, 2) è l’analisi sequenziale in vivo della tomografia microcalcolata (CT) può essere eseguita con facilità e velocità utilizzando 4 cifre, massimizzando così i campioni riducendo al minimo l’uso di animali e l’analisi sequenziale della tomografia microcalcolata in vivo (CT) può essere eseguita con facilità e velocità.

Nel presente studio, mostriamo il piano standardizzato di amputazione P3 per ottenere una risposta di rigenerazione riproducibile e robusta. Inoltre, dimostriamo un protocollo di immunohistochimica a fluorescenza ottimizzato utilizzando sezioni di paraffina per visualizzare la formazione di blastema, la rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione e la conversione blastemica in osso tramite intramembranous Ossificazione. Dimostriamo anche l’uso di una tasie-invivo sequenziale per identificare i cambiamenti nella morfologia ossea, nel volume e nella lunghezza nella stessa cifra nel corso della rigenerazione. L’obiettivo di questo protocollo è quello di studiare la formazione di blastema mammifero dopo l’amputazione e di dimostrare 2 tecniche, immunohistochimica a fluorescenza e in vivo in vivo sequenziale, per lo studio della rigenerazione ossea intramembrana.

Protocol

Tutti gli animali e le tecniche erano conformi alle procedure operative standard dell’Institutional Animal Care and Use Committee della Texas A&M University. 1. Amputazione P3 dell’artino posteriore del topo adulto Anestesizzare un topo CD-1 da 8 a12 settimane utilizzando il gas isoflurano in ossigeno; inizialmente anestesizzare al 3% in una camera, seguita dal 2% isoflurane fornito da un nosecone per tutta la durata dell’intervento. Applicare unguento oftalmico sugl…

Representative Results

I topo adulti che rigenerano le cifre P3 a 6/7 DPA (Figura 2A-D),9 DPA (Figura 2E-H)e 10 DPA (Figura 2I-L) sono stati immunostainse con anticorpi a Runx2, OSX e PCNA per visualizzare l’osso intramembranoso rigenerazione e immunostaincato con anticorpi a CXCR4 e vWF per visualizzare la formazione di blastema. I rendering di cFR rappresentativi delle cifre scansionate prima dell’amput…

Discussion

Questo protocollo descrive una procedura standardizzata di amputazione P3 del topo adulto, colorazione immunohistochimica fluorescente per visualizzare e analizzare la formazione di blastema e l’ossificazione intramembranosa, e la scansione sequenziale in-vivo identificare i cambiamenti morfologici ossei, di volume e di lunghezza dopo l’amputazione. L’amputazione P3 è un modello unico, proceduralmente semplice e riproducibile per analizzare un ambiente di ferite pro-rigenerativo che innesca la formazione di blastema. In…

Materials

Protein Block Serum Free	DAKO	X0909	Ready to use
Mouse anti-PCNA antibody	Abcam	ab29	1:2000 dilution
Rat anti-CXCR4 antibody	R&D Systems	MAB21651	1:500 dilution
Rabbit anti-human vWF XIII antibody	DAKO	A0082	1:800 dilution
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody	Abcam	ab22552	1:400 dilution
Rabbit anti-Runx2 antibody	Sigma-Aldrich Co.	HPA022040	1:250 dilution
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A21235	1:500 dilution
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11008	1:500 dilution
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077	1:500 dilution
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930	Ready to use
Surgipath Decalicifier 1	Leica Biosystems	3800400	Ready to use
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative	Anatech LTD	174	Ready to use
CD-1 Female Mouse	Envigo	ICR(CD-1)	8-12-weeks-old
vivaCT 40	SCANCO Medical