성인 마우스 숫자 절단 및 재생 : 포유류 블라스터 마 형성 및 intramembranous Ossification을 조사하는 간단한 모델
Summary
여기에서, 우리는 형광 성 면역 조직 화학 및 순차적인 생체 내 마이크로 컴퓨터 단층 촬영에 의해 분석된 포유류 배반증 의 형성 및 intramembranous 골화를 조사하기 위하여 성숙한 마우스 말두 지골 절단의 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
여기에서, 우리는 성인 마우스 말단 말두 지골 (P3) 절단의 프로토콜을 제시, 상형 재생의 절차적으로 간단하고 재현 가능한 포유류 모델, 이는 배반 형성및 분석 된 비정형 골화를 포함 형광 면역 조직 화학 및 순차적 인 생체 내 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT). 포유류 재생은 말단 지골(P3)의 말단 영역을 경각시키는 절단으로 제한된다; 더 근위 수준에서 절단 된 숫자는 재생및 섬유 성 치유와 흉터 형성을 받아야하지 않습니다. 재생 반응은 증식 블라스트ema의 형성에 의해 매개되고, 절단 된 골격 길이를 복원하기 위해 intramembranous 골화를 통한 뼈 재생이 뒤따릅니다. P3 절단은 포유동물에서 의상 재생을 조사하는 전임상 모델이며, 성공적인 재생 반응으로 섬유성 치유를 대체하는 치료 전략의 설계를 위한 강력한 도구이다. 우리의 프로토콜은 1) 형광 면역 성 화학을 사용하여 1) 조기 및 후기 블라베ema 세포 집단을 식별하고, 2) 재생의 맥락에서 연구 revascularization, 3) 복잡한 뼈에 대한 필요없이 intramembranous 골화를 조사 안정화 장치. 우리는 또한 절단 후 형태 학적 변화를 검사할 뿐만 아니라 재생 과정에서 동일한 숫자의 볼륨과 길이 변화를 정량화하기 위해 고해상도 이미지를 만들기 위해 생체 내 μCT에서 순차적 사용을 입증합니다. 우리는 이 프로토콜이 포유류에서 에피소드및 조직 재생 반응을 조사하기 위해 엄청난 유용성을 제공한다고 믿습니다.
Introduction
포유동물은 인간 및 마우스를 포함하며, 말단 지골(P3)의 말단 절단 후 그들의 자릿수의 팁을 재생할 수 있는 능력을 가지며,2,3. 마우스에서, 재생 반응은 절단 수준 의존; 점점 근위 수 자릿수 절단P3 네일 매트릭스4,5,6에 절단 시절단에서 완전한 재생 실패까지 점진적으로 감쇠 재생 반응을 표시 , 7명 , 8.P3 재생은 절단된 구조물을 재생하기 위해 형태 형성을 겪는 증식 세포의 집단으로서 정의되는 블라스마의 형성에 의해 매개된다9. 절단에 의해 손실 된 구조를 재생하는 블라스테마의 형성, 프로세스 는 상형 재생이라고, 부상 후 기존의 조직 수리에서 다조직 수준의 P3 재생 반응을 구별6, 10. P3 재생은 상처 치유11,12,뼈 증11,12,및 12를 포함한 복잡한 재생 과정을 조사하는 재현 가능하고 절차적으로 간단한 모델입니다. 혈관신생13,말초신경재생14, 골수변환을 통한 골수변환(15).
면역성 화학을 이용한 이전 연구는 블라마가 이질성, 혈관, 저산소성 및 매우 증식성11,13,15,16임을입증했다. 말단 P3 절단 에 이어, 초기 블라스트마는 처음에 P3 골막 및 내분과 연관되며 뼈표면(15)에인접한 강력한 증식 및 초기 골형성을 특징으로 한다. 뼈 분해 및 상처 폐쇄 후, 이질적인 blastema는 후피오스텔스와 내분과 관련된 세포의 병합에 의해 형성되고, 그 다음에는 인트라엠브라우스 골화를 통해 뼈를 포함한 골반 성분의 분화가 뒤따릅니다. 15.
상해에 응하여 뼈 수리는 전형적으로 endochondral 골화에 의해, 즉 후속 뼈 형성을 위한 템플릿을 형성하는 초기 연골 굳은 살을 통해 발생합니다17,18. 긴 뼈 intramembranous 골화, 즉, 연골 중간체없이 뼈 형성, 일반적으로 복잡한 산만 장치 또는 수술 고정을 사용하여 유도19,20. 자리 재생 반응은 기존의 intramembranous ossification 모델에 비해 이점을 제공하는 전 임상 모델입니다: 1) intramembranous ossification을 자극하기 위하여 외부 또는 내부 고정 포스트 상해를 요구하지 않습니다, 2) 각 동물의 4자리 숫자를 사용하여 수행하여 동물 사용을 최소화하면서 샘플을 최대화하고 3) 생체 내 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 분석을 쉽고 빠르게 수행 할 수 있습니다.
본 연구에서, 우리는 재현 가능하고 강력한 재생 반응을 달성하기 위해 표준화 된 P3 절단 평면을 보여줍니다. 또한, 파라핀 섹션을 사용하여 파라핀 섹션을 사용하여 파라페증 형성, 재생의 맥락에서의 재혈관화, 인트라엠브러스를 통한 뼈로의 배반 변환을 시각화하는 최적화된 형광 면역조직 화학 프로토콜을 시연합니다. 고성화. 우리는 또한 재생 과정에서 동일한 숫자의 뼈 형태, 부피 및 길이의 변화를 식별하기 위해 순차적 인 생체 내 μCT의 사용을 보여줍니다. 이 프로토콜의 목적은 절단 후 포유류 배증마 형성을 조사하고 2 가지 기술, 형광 면역 조직 화학 및 생체 내 순차적 μCT를 입증하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 성인 마우스 말단 P3 절단, 형광 면역 조직 화학 염색의 표준화 된 절차를 설명하여 블라스트마 형성 및 비변형 골화를 시각화하고 조사하고, 순차적으로 생체 내 μCT 스캐닝을 절단 후 골형태, 부피 및 길이 변경을 식별합니다. P3 절단은 blastema 대형을 유발하는 재생 성 상처 환경을 분석하는 독특하고 절차적으로 간단하고 재현 가능한 모델입니다. 또한, P3 자리 모델은 기존의 뼈 부…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
무네오카 연구소와 텍사스 유전체 의학 연구소(TIGM)의 회원들에게 감사드립니다. 이 작품은 텍사스 A & M 대학에 의해 지원되었다.
Materials
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
Referências
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