Voksen mus siffer amputasjon og regenerering: en enkel modell for å undersøke pattedyr blastema formasjon og Intramembranous forbening

Summary

Her presenterer vi en protokoll av voksen mus Terminal falanks amputasjon å undersøke pattedyr blastema dannelse og Intramembranous forbening, analysert av fluorescerende immunhistokjemi og sekvensiell in-vivo microcomputed tomografi.

Abstract

Her presenterer vi en protokoll av voksen mus falanks Terminal (P3) amputasjon, en Prosedyremessig enkel og reproduserbar pattedyr modell av epimorphic gjenfødelse, som innebærer blastema dannelse og Intramembranous forbening analysert av fluorescens immunhistokjemi og sekvensiell in-vivo microcomputed tomografi (Benvolum). Regenerering av pattedyr er begrenset til amputasjoner transecting den delen av Terminal falanks (P3). sifre amputert på mer proksimale nivåer mislykkes i å regenerere og gjennomgå antifibrotiske healing og arrdannelse. Den regenerering responsen er formidlet av dannelsen av en proliferativ blastema, etterfulgt av bein regenerering via Intramembranous forbening å gjenopprette amputert skjelett lengde. P3 amputasjon er en prekliniske modell for å undersøke epimorphic regenerering i pattedyr, og er et kraftig verktøy for utforming av terapeutiske strategier for å erstatte antifibrotiske helbredelse med en vellykket regenererende respons. Vår protokoll bruker fluorescens immunhistokjemi til 1) identifisere tidlig-og-sent blastema celle populasjoner, 2) studie revaskularisering i sammenheng med regenerering, og 3) undersøke Intramembranous forbening uten behov for komplekse bein og stabiliserings enheter. Vi demonstrerer også bruken av sekvensiell in vivo Benvolum for å lage bilder med høy oppløsning for å undersøke morfologiske endringer etter amputasjon, i tillegg til å kvantifisere volum-og lengde endringer i samme siffer i løpet av regenerering. Vi tror denne protokollen tilbyr enorm nytte å undersøke både epimorphic og vev regenererende svar i pattedyr.

Introduction

Pattedyr, inkludert mennesker og mus, har kapasitet til å regenerere tuppen av sine sifre etter en slik amputasjon av Terminal falanks (P3)^1,2,3. I mus, den regenerering responsen er amputasjon-nivå-avhengig; stadig proksimale siffer amputasjoner vise en gradvis svekket regenererende respons til fullstendig regenererende svikt på amputasjoner transecting og proksimale til P3 Nail Matrix^{4,5,6 , 7} andre er ^{, 8}. P3 regenerering er formidlet av dannelsen av en blastema, definert som en befolkning på voksende celler som gjennomgår morphogenesis å regenerere amputert strukturer⁹. Dannelsen av en blastema å regenerere strukturene tapt ved amputasjon, en prosess betegnes epimorphic gjenfødelse, skiller multi-vev-nivå P3 regenerering respons fra tradisjonelle vev reparasjon etter skade^{6, 10}. P3 regenerering er en reproduserbar og Prosedyremessig enkel modell for å undersøke komplekse regenererende prosesser inkludert såret healing¹¹,¹², Bone histolysis^11,12, revaskularisering¹³, perifere nerve regenerering¹⁴, og blastemal konvertering til bein via Intramembranous forbening¹⁵.

Tidligere studier bruker immunhistokjemi har vist at blastema er heterogen, Avascular, hypoxic, og svært proliferativ^11,13,15,16. Etter den begynnende P3 amputasjon, er den tidlige blastema i utgangspunktet knyttet til P3-periosteum og endosteum og kjennetegnes av robust spredning og gryende Osteogenesis ved siden av bein overflaten¹⁵. Etter bein degradering og sår lukking, dannes den heterogene blastema ved sammenslåing av periostal og endosteal celler, etterfulgt av differensiering av blastemal komponenter, inkludert bein via Intramembranous forbening ¹⁵av dem.

Bone reparasjon som svar på skade vanligvis oppstår ved endokondral forbening, dvs via en innledende cartilaginous Callus som danner en mal for påfølgende bein formasjon^17,18. Lange ben Intramembranous forbening, dvs., beindannelse uten cartilaginous mellomliggende, er vanligvis indusert ved hjelp av komplekse distraksjon enheter eller kirurgisk fiksering^19,20. Den sifrede regenerering responsen er en pre-klinisk modell som gir fordeler fremfor konvensjonelle Intramembranous forbening modeller: 1) det krever ikke ekstern eller intern fiksering etter skade for å stimulere Intramembranous forbening, 2) det er utført benytter 4 sifre fra hver dyr, således maksimere eksemplar stund minimere dyr bruk, og 3) sammenhengende inne vivo microcomputed tomografi (Benvolum) analyse kan utført med lette og fart.

I denne studien viser vi standardisert P3 amputasjon flyet for å oppnå en reproduserbar og robust regenerering respons. I tillegg viser vi en optimalisert fluorescens immunhistokjemi protokoll ved hjelp av para fin seksjoner for å visualisere blastema formasjon, revaskularisering i sammenheng med regenerering, og blastemal konvertering til bein via Intramembranous forbening. Vi demonstrerer også bruken av sekvensielle in-vivo Benvolum for å identifisere endringer i bein morfologi, volum og lengde i samme siffer i løpet av regenerering. Målet med denne protokollen er å undersøke pattedyr blastema formasjon etter amputasjon og å demonstrere 2 teknikker, fluorescens immunhistokjemi og sekvensiell in vivo Benvolum, for studiet av Intramembranous bein gjenfødelse.

Protocol

Alle dyr bruk og teknikker var inne medgjørlighet det målestokk fungerer prosedyrer av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité av Texas en & M universitet. 1. voksen mus hind lem og så P3 amputasjon Bedøve en 8 til 12 uke gamle CD-1 mus (tabell av materialer) ved hjelp av isoflurane gass i oksygen; utgangspunktet bedøve på 3% i et kammer, etterfulgt av 2% isoflurane levert av en nosecone over varigheten av operasjonen. Påfør øye salve på øynene for …

Representative Results

Voksen mus regenererer P3 sifre på 6/7 DPA (figur 2a-D), 9 DPA (figur 2e-H), og 10 DPA (figur 2i-L) ble immunostained med antistoffer mot Runx2, OSX og PCNA å visualisere Intramembranous bein regenerering, og immunostained med antistoffer mot CXCR4 og vWF for å visualisere blastema dannelse. Representative Benvolum gjengivelser av sifre skannet før amputasjon og ved ulike tidspu…

Discussion

Denne protokollen beskriver en standardisert prosedyre av voksen mus som er i ferd P3 amputasjon, fluorescerende immunhistokjemiske farging for å visualisere og undersøke blastema formasjon og Intramembranous forbening, og sekvensiell in-vivo Benvolum skanning til identifisere bein morfologiske, volum og lengde endringer etter amputasjon. P3 amputasjon er en unik, Prosedyremessig enkel, og reproduserbar modell for å analysere en Pro-regenererende sår miljø som utløser blastema formasjon. Videre, det P3 tall modell …

Materials

Protein Block Serum Free	DAKO	X0909	Ready to use
Mouse anti-PCNA antibody	Abcam	ab29	1:2000 dilution
Rat anti-CXCR4 antibody	R&D Systems	MAB21651	1:500 dilution
Rabbit anti-human vWF XIII antibody	DAKO	A0082	1:800 dilution
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody	Abcam	ab22552	1:400 dilution
Rabbit anti-Runx2 antibody	Sigma-Aldrich Co.	HPA022040	1:250 dilution
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A21235	1:500 dilution
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11008	1:500 dilution
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077	1:500 dilution
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930	Ready to use
Surgipath Decalicifier 1	Leica Biosystems	3800400	Ready to use
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative	Anatech LTD	174	Ready to use
CD-1 Female Mouse	Envigo	ICR(CD-1)	8-12-weeks-old
vivaCT 40	SCANCO Medical