Взрослая мышь Digit Ампутации и регенерации: Простая модель для расследования формирования млекопитающих Blastema и интрамембранной оссификации
Summary
Здесь мы представляем протокол ампутации фаланги терминала для взрослых мышей для исследования образования бластемы млекопитающих и интрамембранной окостенации, анализируемый флуоресцентной иммуногистохимией и последовательной микрокомпьютерной томографией in-vivo.
Abstract
Здесь мы представляем протокол взрослой мыши дистальной терминальной фаланги (P3) ампутации, процедурно простой и воспроизводимой модели эпиморфной регенерации, которая включает в себя формирование бластемы и интраимбранное окосяждение, проанализированные флуоресценция иммуногистохимия и последовательная микрокомпьютерная томография in-vivo (ККТ). Регенерация млекопитающих ограничивается ампутациями, трансектирующие дистальную область терминальной фаланги (P3); цифры, ампутированные на более проксимальных уровнях, не могут регенерировать и проходят фиброзное заживление и образование рубцов. Реакция регенерации опосредована образованием пролиферативной бластемы, а затем регенерацией костей через интраимбранную окостенение для восстановления ампутированной скелетной длины. Ампутация P3 является доклинической моделью для исследования эпиморфной регенерации у млекопитающих, и является мощным инструментом для разработки терапевтических стратегий для замены фиброзного исцеления с успешной регенеративной реакции. Наш протокол использует флуоресценцию иммуногистохимии 1) определить ранне-поздние популяции бластемных клеток, 2) исследование реваскуляризации в контексте регенерации, и 3) исследовать интраммбранную окостенение без необходимости сложной кости стабилизационные устройства. Мы также демонстрируем использование последовательного in vivo зКТ для создания изображений с высоким разрешением для изучения морфологических изменений после ампутации, а также количественной оценки изменений объема и длины одной и той же цифры в ходе регенерации. Мы считаем, что этот протокол предлагает огромную полезность для исследования как эпиморфных, так и регенеративных реакций тканей у млекопитающих.
Introduction
Млекопитающие, в том числе люди и мыши, имеют возможность регенерировать кончики своих цифр после дистальной ампутации терминальной фаланги (P3)1,2,3. У мышей реакция регенерации зависит от уровня ампутации; все более проксимальной ампутации цифрототвают постепенно ослабленный регенеративный ответ до полного регенеративного отказа при ампутации трансэктинга и проксимальной к матрице ногтей P34,5,6 , 7 (г. , 8. Регенерация P3 опосредована образованием бластемы, определяемой как популяция размножающихсяклеток, которые проходят морфогенез для регенерации ампутированных структур 9. Формирование бластемы для регенерации структур, потерянных в результате ампутации, процесс, называемый эпиморфной регенерации, отличает многотканьья уровня P3 регенерации ответ от традиционного восстановления тканей после травмы6, 10. Регенерация P3 является воспроизводимой и процедурно простой моделью для исследования сложных регенеративных процессов, включая заживление ран11,12,гистолиза костей11,12, реваскуляризации13, периферической регенерации нерва14, и бластремальной преобразования в кости через интраимбранную окостенение15.
Предыдущие исследования с использованием иммуногистохимии показали, что бластема неоднородна, аваскулярная, гипоксическая и высоко размножается11,13,15,16. После дистальной ампутации P3, ранняя бластема первоначально связана с периостеем P3 и эндостерией и характеризуется устойчивым распространением и зарождающимся остеогенезом, примыкающим к костной поверхности15. После деградации костей и замыкания раны, неоднородная бластема формируется в результате слияния периохальных и эндостел-ассоциированных клеток, за которыми следует дифференциация бластремальных компонентов, включая кости через интраимбранное окосоединение 15.
Ремонт костей в ответ на травму обычно происходит путем эндохондральной околения, т.е. через первоначальный хрящевой каллуса, который образует шаблон для последующего формирования костей17,18. Длинная косточка интраимбранной оковласти, т.е. формирование костей без хрящевого промежуточного, обычно индуцируется с помощью сложных отвлекающих устройств или хирургической фиксации19,20. Цифра регенерации ответ является доклинической моделью, которая предлагает преимущества по сравнению с обычными интраимбранной окотопительных моделей: 1) он не требует внешней или внутренней фиксации после травмы, чтобы стимулировать интраимбранной оковласти, 2) это выполняется с использованием 4 цифр от каждого животного, тем самым максимизируя образцы при минимизации использования животных, и 3) последовательный анализ микрокомпьютерной томографии in vivo (ККТ) может быть выполнен с легкостью и скоростью.
В настоящем исследовании мы показываем стандартизированную плоскость ампутации P3 для достижения воспроизводимой и надежной реакции регенерации. Кроме того, мы демонстрируем оптимизированный протокол иммуногистохимии флуоресценции с использованием парафиновых секций для визуализации образования бластемы, реваскуляризации в контексте регенерации и бластремального преобразования в кости через интраимбранные опрокидолизм. Мы также демонстрируем использование последовательного in-vivo зКТ для выявления изменений в морфологии костей, объеме и длине в одной и той же цифре в течение регенерации. Целью этого протокола является исследование образования бластеммлекопитающих после ампутации и демонстрация 2 методов, флуоресценции иммуногистохимии и последовательной in vivo зКТ, для изучения интраимбранной регенерации костей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает стандартизированную процедуру взрослой мыши дистальной ампутации P3, флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание для визуализации и исследования образования бластемы и интраимбранной окостенения, а также последовательное сканирование in-vivo определить ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов лаборатории Muneoka и Техасского института геномной медицины (TIGM). Эта работа была поддержана Техасским университетом А И М.
Materials
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
Referências
- Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
- Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
- Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
- Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
- Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Biologia do Desenvolvimento. 315, 125-135 (2008).
- Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
- Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
- Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
- Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. Biologia do Desenvolvimento. 433, 190-199 (2018).
- Carlson, B. M. . Principles of Regenerative Biology. , (2007).
- Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. Biologia do Desenvolvimento. 350, 301-310 (2011).
- Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
- Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
- Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. Biologia do Desenvolvimento. 445, 237-244 (2018).
- Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
- Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
- Einhorn, T. A. The science of fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).
- Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
- Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
- Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. Biologia do Desenvolvimento. 382, 98-109 (2013).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).
