Amputación y regeneración de dígitos de ratón adultos: un modelo simple para investigar la formación de Blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de amputación de falange terminal de ratón adulto para investigar la formación de blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa, analizada por inmunohistoquímica fluorescente y tomografía microcomputada secuencial in vivo.
Abstract
Aquí, presentamos un protocolo de amputación de falange terminal distal de ratón adulto (P3), un modelo de regeneración epimórfica de mamíferos procedimentalmente simple y reproducible, que implica la formación de blastema y la osificación intrammal inmunohistoquímica de fluorescencia y microtomografía microcomputada secuencial en vivo (CT). La regeneración de mamíferos se limita a las amputaciones que transectan la región distal de la falange terminal (P3); dígitos amputados a niveles más proximales no se regeneran y se someten a curación fibrosa y formación de cicatrices. La respuesta de regeneración está mediada por la formación de un blastema proliferativo, seguido de la regeneración ósea a través de la osificación intramembranosa para restaurar la longitud esquelética amputada. La amputación P3 es un modelo preclínico para investigar la regeneración epimórfica en mamíferos, y es una poderosa herramienta para el diseño de estrategias terapéuticas para reemplazar la curación fibrosa con una respuesta regenerativa exitosa. Nuestro protocolo utiliza inmunohistoquímica de fluorescencia a 1) identificar poblaciones de células blastema tempranas y tardías, 2) estudiar la revascularización en el contexto de la regeneración, y 3) investigar la osificación intramembranosa sin necesidad de hueso complejo dispositivos de estabilización. También demostramos el uso de imágenes secuenciales in vivo-CT para crear imágenes de alta resolución para examinar los cambios morfológicos después de la amputación, así como cuantificar los cambios de volumen y longitud en el mismo dígito en el transcurso de la regeneración. Creemos que este protocolo ofrece una enorme utilidad para investigar las respuestas regenerativas tanto epimórficas como tisulares en mamíferos.
Introduction
Los mamíferos, incluidos los humanos y los ratones, tienen la capacidad de regenerar las puntas de sus dígitos después de la amputación distal de la falange terminal (P3)1,2,3. En ratones, la respuesta de regeneración depende del nivel de amputación; las amputaciones de dígitos cada vez más proximales muestran una respuesta regenerativa progresivamente atenuada hasta que el fallo regenerativo completo en las amputaciones transectantes y proximal a la matriz de uñas P34,5,6 , 7 , 8. La regeneración P3 está mediada por la formación de un blastema, definido como unapoblación de células proliferantes que se someten a morfogénesis para regenerar las estructuras amputadas 9. La formación de un blastema para regenerar las estructuras perdidas por amputación, un proceso llamado regeneración epimórfica, distingue la respuesta de regeneración P3 a nivel multitejido de la reparación de tejido tradicional después de la lesión6, 10. La regeneración P3 es un modelo reproducible y procedimentalmente simple para investigar procesos regenerativos complejos, incluyendo la cicatrización de heridas11,12, histólisis ósea11,12, revascularización13, regeneración del nervio periférico14,y conversión blastemal a hueso a través de osificación intramembranosa15.
Estudios previos con inmunohistoquímica han demostrado que el blastema es heterogéneo, avascular, hipoxico y altamente proliferativo11,13,15,16. Después de la amputación distal de P3, el blastema temprano se asocia inicialmente con el periosteum P3 y el endosteum y se caracteriza por una proliferación robusta y osteogénesis naciente adyacente a la superficie ósea15. Después de la degradación ósea y el cierre de la herida, el blastema heterogéneo se forma por la fusión de células asociadas a periosteales y endosteales, seguido de la diferenciación de componentes blastemales, incluyendo hueso según la osificación intramembranosa 15.
La reparación ósea en respuesta a la lesión se produce típicamente por osificación endochondral, es decir, a través de un callo cartilageonoso inicial que forma una plantilla para la posterior formación ósea17,18. La osificación intramembranosa ósea larga, es decir, la formación ósea sin un intermedio cartilaginoso, se induce comúnmente utilizando dispositivos de distracción complejos o fijación quirúrgica19,20. La respuesta de regeneración de dígitos es un modelo preclínico que ofrece ventajas sobre los modelos convencionales de osificación intramembranosa: 1) no requiere fijación externa o interna después de una lesión para estimular la osificación intramembranosa, 2) es realizado utilizando 4 dígitos de cada animal, maximizando así las muestras y minimizando el uso de animales, y 3) el análisis secuencial de microcomputación in vivo (CT) se puede realizar con facilidad y velocidad.
En el presente estudio, mostramos el plano de amputación P3 estandarizado para lograr una respuesta de regeneración reproducible y robusta. Además, demostramos un protocolo optimizado de inmunohistoquímica de fluorescencia utilizando secciones de parafina para visualizar la formación de blastema, la revascularización en el contexto de la regeneración y la conversión blastemal a hueso a través de Osificación. También demostramos el uso de la c.CT secuencial para identificar los cambios en la morfología ósea, el volumen y la longitud en el mismo dígito en el transcurso de la regeneración. El objetivo de este protocolo es investigar la formación de blastema de mamíferos después de la amputación y demostrar 2 técnicas, inmunohistoquímica de fluorescencia y secuencial in vivo-CT, para el estudio de la regeneración ósea intramembranosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un procedimiento estandarizado de amputación disal de P3 de ratón adulto, tinción inmunohistoquímica fluorescente para visualizar e investigar la formación de blastema y la osificación intramembranosa, y escaneo secuencial en vivoCT para identificar los cambios morfológicos, de volumen y longitud óseas después de la amputación. La amputación P3 es un modelo único, procedimentalmente simple y reproducible para analizar un entorno de heridas pro-regenerativo que desencadena la formación…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del Laboratorio Muneoka y del Instituto de Medicina Genómica de Texas (TIGM). Este trabajo fue apoyado por la Universidad Texas A&M.
Materials
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
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