Här presenterar vi ett protokoll för Adult Mouse Terminal phalanx amputation för att undersöka däggdjur embryon formation och intramembranös ossification, analyseras med fluorescerande immunohistokemi och sekventiell in-vivo mikrodatortomografi.
Här presenterar vi ett protokoll för vuxna mus distala Terminal phalanx (P3) amputation, en processuellt enkel och reproducerbar däggdjurs modell av epimorfiska förnyelse, vilket innebär embryon bildning och intramembranös benbildning analyseras av fluorescensimmunohistokemi och sekventiell in vivo-mikrodatortomografi (μCT). Föryngring av däggdjur är begränsad till amputationer som transekera distala regionen av terminalen falangen (P3); siffror amputerade vid mer proximala nivåer misslyckas med att regenerera och genomgå fibrotisk läkning och ärrbildning. Regenereringsrespons förmedlas genom bildandet av en proliferativ BLASTEMA, följt av ben förnyelse via intramembranös ossifiering för att återställa amputerad skelett längd. P3 amputation är en preklinisk modell för att undersöka epimorfiska regenerering hos däggdjur, och är ett kraftfullt verktyg för utformningen av terapeutiska strategier för att ersätta fibrotisk läkning med en lyckad regenerativ respons. Vårt protokoll använder fluorescensimmunohistokemi till 1) identifiera tidiga och sena embryon cellpopulationer, 2) studie revaskularisering i samband med förnyelse, och 3) undersöka intramembranös ossifikation utan behov av komplexa ben stabiliseringsanordningar. Vi visar också användningen av sekventiell in vivo μCT för att skapa högupplösta bilder för att undersöka morfologiska förändringar efter amputation, samt kvantifiera volym och längdförändringar i samma siffra under loppet av förnyelse. Vi tror att detta protokoll erbjuder enorma verktyg för att undersöka både epimorfiska och vävnad regenerativ svar hos däggdjur.
Däggdjur, inklusive människor och möss, har kapacitet att regenerera tips av sina siffror efter distala amputation av terminalen falangen (P3)1,2,3. I möss är regenereringssvaret amputation-nivå-beroende; alltmer proximala amputationer visar ett progressivt försvagat regenerativt svar tills fullständig regenerativ svikt vid amputationer transekera och proximalt till P3-Nagel matrisen4,5,6 , 7 , 8. P3 Regeneration medieras av bildandet av en BLASTEMA, definierad som en population av prolifererande celler som genomgår morfogenes för att återskapa de amputerade strukturerna9. Bildandet av en embryon att regenerera strukturer förlorade genom amputation, en process som kallas epimorfiska förnyelse, skiljer multi-vävnad-nivå P3 förnyelse svar från traditionell vävnad reparation efter skada6, 10. P3 regeneration är en reproducerbar och processuellt enkel modell för att undersöka komplexa regenerativa processer inklusive sårläkning11,12, ben histolys11,12, revaskularisering13, perifer nervregeneration14, och blastemal omvandling till ben via intramembranös ossifikation15.
Tidigare studier med immunohistokemi har visat att embryon är heterogena, avaskulära, hypoxiska, och mycket proliferativ11,13,15,16. Efter den distala P3-amputation associeras tidigt embryon initialt med P3 periostet och endosteum och kännetecknas av robust proliferation och begynnande osteogenes i anslutning till ben ytan15. Efter bennedbrytning och sår stängning bildas den heterogena embryon genom sammanslagning av periostal och endosteal-associerade celler, följt av differentiering av blastemal komponenter inklusive ben via intramembranös ossifikation 15.
Ben reparation som svar på skada uppstår vanligen genom endochondral benbildning, dvs via en initial brosk förhårdnader som bildar en mall för efterföljande benbildning17,18. Långa ben intramembranös ossifikation, dvs benbildning utan en brosk intermediär, är vanligen induceras med hjälp av komplexa distraktion enheter eller kirurgisk fixering19,20. Siffran regenereringsrespons är en preklinisk modell som erbjuder fördelar jämfört med konventionella intramembranösa benbildning modeller: 1) det kräver inte yttre eller inre fixering efter skada för att stimulera intramembranös benbildning, 2) det är utförs med 4 siffror från varje djur, vilket maximerar prover samtidigt minimera djuranvändning, och 3) sekventiell in vivo mikrodatortomografi (μCT) analys kan utföras med lätthet och hastighet.
I den nuvarande studien visar vi det standardiserade P3-amputation-planet för att uppnå ett reproducerbart och robust regenereringssvar. Dessutom, vi visar en optimerad fluorescens immunohistokemi protokoll med paraffin sektioner för att visualisera embryon bildning, revaskularisering i samband med förnyelse, och blastemal omvandling till ben via Intramembranous Förbening. Vi visar också användningen av sekventiell in vivo μCT för att identifiera förändringar i ben morfologi, volym och längd i samma siffra under regenereringen. Målet med detta protokoll är att undersöka bildandet av embryon från däggdjur efter amputation och att demonstrera 2 tekniker, fluorescensimmunohistokemi och sekventiell in vivo μct, för studiet av intramembranös ben förnyelse.
Detta protokoll beskriver ett standardiserat förfarande för vuxna mus distala P3 amputation, fluorescerande immunohistokemisk färgning för att visualisera och undersöka embryon bildning och intramembranös ossification, och sekventiell in vivo μct skanning till identifiera ben morfologiska, volym och längdförändringar efter amputation. P3 amputation är en unik, processuellt enkel och reproducerbar modell för att analysera en proregenerativ sårmiljö som utlöser embryon-bildning. Dessutom erbjuder den P3-siff…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmar i Muneoka Lab och Texas Institute for genomisk medicin (TIGM). Detta arbete stöddes av Texas A & M University.
Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
vivaCT 40 | SCANCO Medical |