Yetişkin fare basamak amputasyon ve rejenerasyonu: Mammalin Blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon araştırmak için basit bir model
Summary
Burada, meme blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon araştırmak için yetişkin fare terminali falanks amputasyon bir protokol sunuyoruz, floresan immünhistokimya ve sıralı in-vivo MİKROBİLGİSAYARLI tomografi ile analiz.
Abstract
Burada, biz bir protokol yetişkin fare distal Terminal falanks (P3) amputation, epimorphic rejenerasyon, bir procedurally basit ve tekrarlanabilir memeli modeli mevcut blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon tarafından analiz içerir Floresan immünhistokimya ve sıralı in-vivo MİKROBİLGİSAYARLI tomografi (μCT). Memelinin rejenerasyonu Terminal falanks distal bölgesini (P3) aktaran amputasyonlar ile sınırlıdır; daha proksimal düzeylerde bacağı rakamları yeniden ve fibrotik şifa ve yara oluşumu geçmesi başarısız. Rejenerasyon tepkisi, amputasyonlu iskelet uzunluğunu geri yüklemek için Intramembranous ossifikasyon yoluyla kemik rejenerasyonu takiben proliferatif bir blastema oluşumu ile aracılık edilir. P3 amputasyon memelilerde epimamorfik rejenerasyon araştırmak için bir preklinik model, ve başarılı bir rejeneratif tepki ile fibrotik şifa yerine terapötik stratejilerin tasarımı için güçlü bir araçtır. Protokolimiz 1) erken ve geç blastema hücre nüfus, 2) rejenerasyon bağlamında revaskülarizasyon çalışma ve 3) tanımlamak için floresan immünhistokimya kullanır karmaşık kemik gerek kalmadan Intramembranous ossifikasyon araştırmak stabilize cihazları. Ayrıca, amputasyon sonrası morfolojik değişiklikleri incelemek için yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için sıralı in vivo μCT kullanımını da gösteriyoruz, aynı basamak içindeki hacim ve uzunluk değişikliklerini yenilenme sırasında ölçmek. Bu protokolün memelilerde hem epimamorfik hem de doku rejeneratif yanıtlarını araştırmak için muazzam bir yarar sunuyor olduğuna inanıyoruz.
Introduction
İnsanlar ve fareler de dahil olmak üzere memeliler, Terminal falanks (P3)1,2,3distal amputasyon sonra rakamlarının ipuçlarını yeniden oluşturmak için kapasitesine sahip. Farelerde, rejenerasyon tepkisi amputation düzeyine bağlıdır; giderek proksimal basamaklı amputasyonlar, P3 çivi matrisine geçiş ve proksimal Amputasyonların tam rejeneratif yetmezliği4,5,6 ‘ ya kadar aşamalı olarak zayıflatılmış rejeneratif tepkisi görüntüler , 7 , 8. P3 rejenerasyon bacağı yapıları yeniden oluşturmak için morfojenler oluşan Proliferasyona hücrelerin bir nüfus olarak tanımlanan bir blastema oluşumu ile arabulmalı9. Amputasyon ile kayıp yapıları yeniden oluşturmak için bir blastema oluşumu, bir süreç epimorphic yenilenme olarak adlandırılan, yaralanma sonra geleneksel doku onarımı çok doku düzeyinde P3 rejenerasyon yanıtı ayırt6, 10. P3 rejenerasyon yara şifa11,12, kemik histoliz11,12dahil karmaşık rejeneratif süreçleri araştırmak için tekrarlanabilir ve procedurally basit bir modeldir, revaskülarizasyon13, periferal sinir rejenerasyonu14, ve Intramembranous ossifikasyon yoluyla kemiğe blastemal dönüşümü15.
İmmunohistokimya kullanarak önceki çalışmalar blastema heterojen olduğunu göstermiştir, avasküler, hipoktik, ve yüksek proliferatif11,13,15,16. Distal P3 amputasyonu sonrasında, erken blastema başlangıçta P3 periost ve endosteum ile ilişkilidir ve kemik yüzeyinin bitişiğinde sağlam proliferasyon ve nazcent osteogenezi ile karakterize edilir15. Kemik bozulması ve yara kapanışı sonrasında, heterojen blastema periosteal ve endosteal ilişkili hücrelerin birleşmesiyle oluşur, ardından Intramembranous ossifikasyon yoluyla kemik dahil olmak üzere blastemal bileşenlerin farklılaşması 15 yaşında.
Travmaya yanıt olarak kemik onarımı genellikle endokondral ossifikasyon tarafından oluşur, yani sonraki kemik oluşumu için bir şablon oluşturan ilk kıkırdak nasır üzerinden17,18. Uzun kemik Intramembranous ossifikasyon, yani, bir kıkırdak ara olmadan kemik oluşumu, yaygın karmaşık distraksiyon cihazları veya cerrahi fiks kullanılarak indüklenir19,20. Basamak rejenerasyon yanıtı konvansiyonel Intramembranous ossifikasyon modelleri üzerinde avantaj sunan bir ön klinik modeldir: 1) Intramembranous ossifikasyon uyarmak için dış veya iç fikresiyon sonrası yaralanma gerektirmez, 2) Her hayvandan 4 basamak kullanılarak gerçekleştirilen, böylece hayvanların kullanımını minimize ederken örnekleri maksimize, ve 3) sıralı in vivo MİKROBİLGİSAYARLI tomografi (μCT) analizi kolay ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir.
Bu çalışmada, yeniden üretilebilen ve sağlam bir rejenerasyon tepkisi elde etmek için standartlaştırılmış P3 amputasyonu düzlemini gösteriyoruz. Ayrıca, blastema oluşumu, rejenerasyon bağlamında revaskülarizasyon ve Intramembranous yoluyla kemiğe blastemal dönüşümü görselleştirmek için parafin bölümlerini kullanarak optimize edilmiş bir floresan immünhistokimya Protokolü gösteriyoruz. Kemikleşme. Ayrıca, rejenerasyon sırasında aynı basamakta kemik morfoloji, hacim ve uzunluğundaki değişiklikleri belirlemek için sıralı in-vivo μCT kullanımını da gösteriyoruz. Bu protokolün amacı, Amputasyondan sonra memelilik blastema oluşumunu araştırmak ve Intramembranous kemik rejenerasyonunun incelenmesi için 2 Teknik, floresans immünhistokimya ve sıralı in vivo μct göstermektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, Yetişkin fare distal P3 Amputasyonunun standartlaştırılmış bir prosedürünü, blastema oluşumunu ve Intramembranous ossifikasyonu görselleştirmek ve araştırmak için floresan immünhistokimyasal boya, ve sıralı in-vivo μct taramasını açıklar kemik morfolojik, hacim ve uzunluk değişiklikleri amputasyon sonrası tanımlayın. P3 amputasyonu, blastema oluşumunu tetikleyen bir rejeneratif yara ortamını analiz etmek için benzersiz, prosedüre basit ve tekrarlanabilir bir modeldir. Ayrıca…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Muneoka Lab ve Teksas genomik Tıp Enstitüsü (TıGM) üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma Texas A & M Üniversitesi tarafından destekleniyordu.
Materials
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
Referências
- Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
- Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
- Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
- Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
- Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Biologia do Desenvolvimento. 315, 125-135 (2008).
- Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
- Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
- Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
- Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. Biologia do Desenvolvimento. 433, 190-199 (2018).
- Carlson, B. M. . Principles of Regenerative Biology. , (2007).
- Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. Biologia do Desenvolvimento. 350, 301-310 (2011).
- Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
- Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
- Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. Biologia do Desenvolvimento. 445, 237-244 (2018).
- Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
- Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
- Einhorn, T. A. The science of fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).
- Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
- Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
- Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. Biologia do Desenvolvimento. 382, 98-109 (2013).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).
