इस अनुच्छेद के लक्ष्य के लिए एकलक अल्फा-synuclein, बाद में गुणवत्ता नियंत्रण से तंतुओं के उत्पादन के लिए आवश्यक कदम रूपरेखा है, और vivo में preformed तंतुओं का उपयोग करें ।
में का उपयोग करें vivo अल्फा-synuclein preformed तंतुक (α-syn pff) synucleinopathy के मॉडल मॉडल पार्किंसंस रोग synucleinopathy और nigrostriatal अध: पतन के लिए लक्ष्य शोधकर्ताओं के बीच लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है । एक समान, मजबूत α-सिन विकृति को सुनिश्चित करने के लिए α-syn PFF उत्पादन और vivo अनुप्रयोग में मानकीकरण महत्वपूर्ण है । यहां, हम एकलक α-syn से तंतुओं के उत्पादन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत, बाद तंतुओं गुणवत्ता नियंत्रण कदम है, और चूहों या चूहों में α-syn pffs के सफल तंत्रिकाशल्यक इंजेक्शन के लिए मानकों का सुझाव दिया । एकलक α-syn के साथ शुरू, fibrilization एक 7 दिन ऊष्मायन अवधि के दौरान होता है, जबकि इष्टतम बफर शर्तों, एकाग्रता में मिलाते हुए, और तापमान । पोस्ट-fibrilization गुणवत्ता नियंत्रण अवसादन परख, एक thioflavin टी परख के साथ fibrilization में amyloid रचना के गठन, और इलेक्ट्रॉन fibrilization के सूक्ष्म दृश्य के द्वारा पेलेटेबल fibrilization की उपस्थिति से मूल्यांकन किया है । सफल सत्यापन इन assays का उपयोग कर सफलता के लिए आवश्यक है, जबकि वे PFFs की गारंटी करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं, एक PFFS बैच के इस तरह के एकत्रीकरण गतिविधि कोशिका संस्कृति में परीक्षण किया जाना चाहिए या पायलट पशु साथियों में उपयोग करने से पहले, pffs ठीक मानकीकृत शर्तों के तहत sonicated किया जाना चाहिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या गतिशील प्रकाश बिखरने का उपयोग कर परीक्षा के बाद की पुष्टि करने के लिए तंतुक लंबाई इष्टतम आकार रेंज के भीतर हैं, ५० एनएम की औसत लंबाई के साथ । PFFs तो सेल संस्कृति मीडिया के लिए जोड़ा जा सकता है या जानवरों में इस्तेमाल किया । रोगविज्ञान द्वारा detectable के लिए immunostaining फ़ॉस्फोरोलेटेड α-syn (psyn; सेरीन १२९) है स्पष्ट दिनों या सप्ताह बाद में सेल संस्कृति और कृंतक मॉडल में, क्रमशः ।
बड़े पैमाने पर और प्रगतिशील अल्फा-synuclein (α-सिन) विकृति विज्ञान, और निग्रोस्ट्रीटल अध: पतन-पार्किंसंस रोग (पीडी) मुख्य रूप से दो प्रमुख रोग सुविधाओं द्वारा पोस्टमार्टम की विशेषता है । Wildtype चूहों या चूहों में इंजेक्शन के बाद, α-syn preformed फाइनेल्स (pffs) रोग α-syn के प्रगतिशील संचय प्रेरित है, जो कई के पाठ्यक्रम पर एक प्रकार का पौधा नाइग्रा परस compacta (snpc) डोपामाइन ंयूरॉंस के दीर्घकालिक पतन में परिणाम कर सकते है महीने, साथ ही ज्ञानेंद्रिय घाटे1,2,3,4,5,6। ंयूरॉंस α-syn fibrils को उजागर कर रहे हैं, या तो प्रत्यक्ष इंट्रा इंजेक्शन के माध्यम से या संवर्धित ंयूरॉंस के मीडिया के लिए कहा । जब pffs ंयूरॉंस में ले रहे हैं, pffs करने के लिए अधिनियम “बीज” templating के माध्यम से inclusions के गठन, और अंतर्जात α-सिन का संचय फॉस्फोलयुक्त inclusions में1,7,8, ९। शामिल Lewy निकायों के लिए इसी तरह के गुणों का हिस्सा: α-syn सेरीन १२९ (pSyn), ubiquitin, और p62 पर फॉस्फोलिलेटेड युक्त; एमीलॉयड चतुष्क संरचनाओं के रूप में सकारात्मक thioflavin धुंधला के साथ दिखाया गया है; और proteinase कश्मीर पाचन के लिए प्रतिरोधी रहे हैं1,3,5,7,8,9,10,11, १२। Pff जोखिम की ओर जाता है α-सिन समावेश निर्माण in the प्राथमिक and कुछ अमर ंयूरॉंस in संस्कृति, साथ ही साथ चूहों, चूहों, and गैर मानव वानरों in वीवो1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13। यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि PFFs करने के लिए नेतृत्व नहीं करेगा α-syn सभी सेल संस्कृति मॉडल और कुछ सुसंस्कृत ंयूरॉंस दूसरों की तुलना में बेहतर होगा में शामिल गठन ।
में vivo α-syn PFF मॉडल की एक अंय महत्वपूर्ण विशेषता अलग अनुक्रमिक रोग चरणों है कि कई महीनों में उभरने है । कृंतकों में, intrastriatal इंजेक्शन के बाद, α-सिन समावेश गठन आम तौर पर snpc और कई वल्कुट क्षेत्रों के भीतर 1-2 महीने के भीतर चोटियों । इस एकत्रीकरण शिखर nigrostriatal अध: पतन ≈ 2-4 महीने बाद1,3,5के बाद है । ये अलग रोग चरणों शोधकर्ताओं मंच के साथ जो अध्ययन करने के लिए और रणनीतियों कि 1) कम α-syn एकत्रीकरण, 2) स्पष्ट पहले से ही बनाया α-syn inclusions, और/ Pff मॉडल के रूप में पहले की समीक्षा की6neurotoxicant, ट्रांसजेनिक, और वायरल वेक्टर मध्यस्थता α-syn overexpression मॉडल की तुलना में विशिष्ट फायदे और नुकसान प्रदान करता है । जो मॉडल या दृष्टिकोण लेने के लिए विकल्प है जो मॉडल सबसे अच्छा सवाल जांचकर्ताओं पूछ रहे हैं सूट द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए ।
हालांकि pff मॉडल सफलतापूर्वक कई प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया गया है, वहाँ अभी भी समूहों है कि तंतुओं पैदा करने और लगातार α-syn विकृति14उत्पादन के साथ असंगतताओं का अनुभव किया है । असंगतताओं के उदाहरण pffs से सीमा है कि उत्पादन कम या कोई α-syn विकृति, बैच बोने दक्षता बैच के लिए, और यहां तक कि तंतुओं की विफलता के लिए फार्म का । इस प्रकार, α-syn PFF पीढ़ी और vivo में आवेदन में मानकीकरण के क्रम में उपंयास चिकित्सीय हस्तक्षेप के प्रभाव के बारे में सटीक व्याख्याओं के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है । निंनलिखित प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक चरणों की रूपरेखा α-सिन monomers से PFFs के उत्पादन के लिए, में इन विट्रो की गुणवत्ता नियंत्रण PFFs का गठन एक बार, sonication और PFFs के माप का उपयोग करने से पहले, और सुझावों में सफल होने की सुविधा के लिए vivo के इंजेक्शन चूहों या चूहों में PFFs ।
Α-सिन पफ्स का उत्पादन न्यूरॉन्स बोने में सक्षम होता है तथा लेवी शरीर जैसे समावेशन के लिए अग्रणी होता है, जो अनेक कारकों और चरणों पर निर्भर करता है । एक महत्वपूर्ण कारक यह है कि तंतुओं पैदा करने के लिए इस्तेमाल मोनोमर्स विशेष रूप से4,9,14,15तंतुओं के लिए तैयार की जरूरत है । यदि मोनोमर्स फाइनेसिरेनीकरण के लिए तैयार नहीं किए जाते हैं, तो फाइनेल्स फार्म नहीं हो सकते हैं या ऐसा करने वाले फाइनेल्स α-सिन विकृति उत्पन्न नहीं कर सकते हैं । इसी प्रकार, वह बफर जो मोनोमर्स में भी फाइनेरेयीकरण को प्रभावित करता है । इस प्रकार, सबसे अच्छा परिणाम के लिए, नमक एकाग्रता लगभग १०० mM NaCl और पीएच ७.० और ७.३ के बीच होना चाहिए । एक आरंभिक चरण जो परिवर्तनीयता का परिचय देता है वह विधि है जिसके द्वारा आरंभिक प्रोटीन सामग्री निर्धारित की जाती है, A280 पर मापन के साथ अधिक सटीक परिणाम उत्पन्न करने की संभावना होती है और इसलिए यह पसंदीदा विधि है । प्रोटीन एकाग्रता में विसंगति fibrilization प्रक्रिया की प्रभावकारिता को कम कर सकते हैं, साथ ही साथ कल्पित PFF एकाग्रता प्रयोगों में इस्तेमाल किया बदल । दोनों प्रयोगों के बीच दक्षता और बैच भिन्नता बोने में कमी करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
प्रारंभिक गुणवत्ता नियंत्रण कदम PFFs के महत्वपूर्ण विशेषताओं की पुष्टि करेंगे, विशेष रूप से है कि वे एक रेशेदार संरूपण (इलेक्ट्रॉन microscopy), amyloid संरचनाओं (thioflavin T परख) होते हैं, और pelletable (अवसादन परख) हैं । यह ध्यान दें कि thioflavin T परख के परिणाम समय के साथ उतार चढ़ाव और amyloid वर्तमान संरचनाओं की राशि का एक सीधा उपाय नहीं कर रहे है महत्वपूर्ण है, बल्कि, thioflavin टी परख केवल amyloid संरचनाओं के भीतर उपस्थिति का एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए नमूना है । Thioflavin टी आम तौर पर में प्रयोग किया जाता है इन विट्रो assays हैं, जैसे aforementioned परख के रूप में दिखाने के लिए तंतुओं amyloid संरचनाओं होते हैं । वैकल्पिक रूप से, thioflavin S ऊतक में प्रयोग किया जाता है amyloid संरचनाओं का पता लगाने के लिए, के रूप में चित्र 7में दिखाया गया है । में अवसादन परख करने का संबंध है, परिणाम ही पता चलता है कि PFFs मुख्यतः pelletable अंश में पाए जाते हैं । जैसा कि नमूनों को विकृत स्थितियों में चलाया जाता है, लगभग 14 केडीए का एक प्रमुख बैंड, α-सिन मोनोमर्स का आकार जैल पर मौजूद होता है । यह कई उच्च आणविक वजन है कि PFFs के साथ की उंमीद की जाएगी पर मौजूद बैंड के विपरीत है अगर एक देशी या गैर denaturing जेल का इस्तेमाल किया गया था । अंत में, इन सभी प्रारंभिक गुणवत्ता नियंत्रण कदम के सफल पासिंग α-syn शामिल बोने की क्रिया गतिविधि की गारंटी नहीं है । इस कारण से, सेल संस्कृति प्रयोगों या एक छोटा सा सहचर शल्य चिकित्सा इंजेक्शन जानवरों के लिए बड़े प्रयोगों में उपयोग करने से पहले PFFs की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
Sonication प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है और मानकों का इस्तेमाल किया sonicator के मॉडल के आधार पर अलग होगा । Sonication के मापदंडों को लागू किया जाना चाहिए और कि कम PFF टुकड़े का उत्पादन किया गया है दिखाने के लिए सत्यापित । Fibril आकार बोने पर असर पड़ता है, कम fibril अधिक कुशलता से बोने के साथ । हालांकि छोटे तंतुओं बीज और अधिक कुशलता से, इस प्रभाव पठारों और इष्टतम pff लंबाई लगभग ५० एनएम4,18है । यह भी महत्वपूर्ण है नहीं करने के लिए नमूने sonicate और अत्यधिक गर्मी के लिए PFFs बेनकाब, के रूप में यह बीज बोने की क्षमता कम हो सकती है । इन sonicated PFFs छोटे सेल संस्कृति में प्रभावकारिता के लिए या vivo प्रयोगों में बड़े पैमाने पर प्रयोग करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए । विभिन्न sonication सत्र परिवर्तनशीलता को लागू करने की क्षमता है के रूप में, प्रयोगात्मक उपचार समूहों तदनुसार योजना बनाई जानी चाहिए ।
जब vivo में pffs पहुंचाने, इंजेक्शन साइट (ओं) का स्थानीयकरण और कुल राशि का उपयोग किया जाता है कि ंयूरॉंस की संख्या को प्रभावित कर सकते है inclusions के रूप में के रूप में अच्छी तरह से neuroव्यपजनन की हद तक7,14। प्रोटोकॉल में निर्देशांक एक जगह शुरू करने के लिए प्रदान करते हैं, लेकिन प्रयोगशाला के भीतर परीक्षण किया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए वांछित लक्ष्य क्षेत्र में विकसित α-syn विकृति पहले बड़े पैमाने पर प्रयोग में उपयोग करने के लिए । यदि इच्छित, ट्रैकिंग डाई या फ्लोरोसेंट मोती एक तरह से PFFs का उपयोग करने से पहले क्षेत्रीय लक्ष्यीकरण का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Vivo में इस्तेमाल किया pffs की राशि समूहों के बीच बदलता है, अधिकांश समूहों के बीच एक पर pffs के 5 से 20 माइक्रोग्राम के बीच कुल का उपयोग कर या दो इंजेक्शन साइटों के बीच विभाजित1,2,3,4,5 , 6 । , 7 । , 14. इंजेक्शन साइटों की संख्या के रूप में, इंजेक्शन साइटों की जगह है, और इंजेक्शन pffs की राशि प्रभाव परिणाम और synucleinopathy की प्रगति कर सकते हैं, इस्तेमाल किया मापदंडों के डाउनस्ट्रीम परिणामों के लिए मॉडल का उपयोग करने से पहले विशेषता होना चाहिए संभावित हस्तक्षेपों का परीक्षण या मॉडल की लौकिक सुविधाओं की जांच ।
जब एक मॉडल का चयन करने के लिए चिकित्सा विज्ञान के परीक्षण या रोग प्रगति का अध्ययन करने के लिए उपयोग करते हैं, का उपयोग किया मॉडल सबसे अच्छा सवाल का जवाब के लिए चुना जाना चाहिए पूछा । नहीं सभी मॉडलों पीडी के कुछ रोग सुविधाओं के अधिकारी, या संभावित हस्तक्षेपों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक समय सीमा की पेशकश करेगा । PFF मॉडल पीडी की प्रमुख विशेषताओं जैसे α-syn विकृति और neuroव्यपजनन, और मामूली मोटर impairments के लिए नेतृत्व कर सकते हैं recapitulates । मॉडल एक उंमीद के मुताबिक और लंबी समय पाठ्यक्रम है, जहां neuroव्यपजनन से पहले फार्म का महीने inclusions प्रदान करता है । यह शोधकर्ताओं की जांच करने के लिए और synucleinopathy की लंबी प्रगति भर में विभिंन चरणों का फायदा उठाने की अनुमति देता है । इस मॉडल के वर्तमान और भविष्य के उपयोग के लिए रोग प्रगति और उपंयास चिकित्सा के विकास के अध्ययन में फायदेमंद होने की उंमीद है ।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (NS099416) और वेस्टन ब्रेन इंस्टीट्यूट से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया ।
1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.036″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.044″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
Orange Medical Shrink Tubing (0.021″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |