모노 머 로부터 미리 형성 된 섬유 소의 알파-시 뉴 클레 인 생성 및 생체 내 사용

Summary

이 기사의 목표는 단량체 성 알파-sy뉴 클레 인, 후속 품질 관리 및 생체 내에서 미리 형성 된 섬유 소의 사용 으로부터 피 브 릴의 생성에 필요한 단계를 간략하게 설명 하는 것입니다.

Abstract

생체 내 알파-시 뉴 핀 (α-syn PFF) 모델의 시 뉴 트리 트의 사용은 파 킨 슨 병 질환 및 근 병 변성을 모델링 하는 것을 목표로 연구자 들 사이에서 인기를 얻고 있다. Α-syn PFF 생성 및 생체 내 적용의 표준화는 일관 되 고 강력한 α-syn 병리학을 보장 하기 위해 매우 중요 합니다. 여기서, 우리는 단량체 성 α-syn, 후 섬유 화 품질 관리 단계 및 쥐 또는 마우스에 α-syn PFFs의 성공적인 신경 외과 주입을 위한 제안 된 매개 변수 로부터 피 브 릴의 생성을 위한 상세한 프로토콜을 제시 한다. 단량체 성 α-syn을 시작으로, 섬유 화는 최적의 완충 조건, 농도 및 온도에서 흔들리는 동안 7 일간의 인큐베이션 기간 동안 발생 합니다. 후 섬유 화 품질 관리는 침전 분석을 통해 펠 렛 테이블 섬유 소의 존재에 의해 평가 되며, thioflavin T 검정 법으로 피 브 릴에서 아 밀 로이드 입체 형성을 형성 하 고, 섬유 소의 전자 현미경을 시각화 합니다. 이러한 분석 법을 이용한 성공적인 검증이 성공에 필요한 반면, 각 PFFS 배치의 응집 활성이 세포 배양 또는 파일럿 동물 집단에서 시험 되어야 하므로 PFFs가 뉴런에 α-syn 개재 물을 종자 할 것을 보장 하기에 충분 하지 않다. 사용 하기 전에 PFFs는 정밀 하 게 표준화 된 조건 하에서 초음파 처리 되어야 하며, 그 다음에는 전자 현미경 또는 동적 광산 산란을 사용 하 여 피 브 릴 길이가 최적의 크기 범위 내에 있는지 확인 하 고 평균 길이는 50 nm입니다. PFFs는 세포 배양 배지에 첨가 되거나 동물에서 사용 될 수 있다. 인 산화 된에 대 한 면역 염색에 의해 검출 가능한 병리학은 α-syn (psyn; 세 린 129)은 세포 배양 및 설치류 모델 각각에서 며칠 또는 몇 주 후에 명백 하다.

Introduction

파 킨 슨 병 (PD)은 주로 두 가지 주요 병리학 적 특징에 의해 사후 치료를 특징으로 합니다: 광범위 하 고 진보적인 알파 시 뉴 신 (α-syn) 병리학 및 니로 트리 아 변성. 야생 형 쥐 또는 쥐에 주입 다음, α-syn 미리 형성 된 섬유 소 (pffs)는 병리학 적 α-syn의 진보적 인 축적을 유도 하 여 많은 과정을 거쳐 입증 된 니 그 라 파르스 compacta (snpc) 도파민 뉴런의 프로톤 화 변성을 유발할 수 있습니다. 뿐만 아니라, 센 소리 모터 적자의^1,2,⁵,⁶. 뉴런은 직접 뇌 내 주입을 통해 또는 배양 된 뉴런의 매체에 첨가 된 α-syn 섬유 소에 노출 됩니다. Pffs가 뉴런으로 촬영 될 때, pffs는 템플릿 화를 통해 개재 물의 형성을 “종자” 하 고, 내 인 성 α-syn을 인 산화 된 개재물에 축적 하는 작용을 하 고,⁷,^{8 9}. 포함은 Lewy 바디에 유사한 속성을 공유 합니다: 세 린 129 (pSyn), 유비퀴틴 및 p62에서 α-syn 인 산화 된을 함유 하 고; 긍정적인 thioflavin 염색과 같이 아 밀 로이드 4 급 구조물을 소유 하십시오; 그리고 프로 테이 지 K 소화에 대 한 내성이 있고, 제^1,제⁵,⁸,¹⁰,^{11 12}. Pff 노 광은 마우스, 랫 트 및 비 인간 영장류에서의¹차 및 일부 불멸 화 뉴런에서의 α-syn 포 접 형성에 이르게 한다. ⁶,⁸,⁹,¹³. PFFs는 모든 세포 배양 모형에 있는 α-syn 포용 형성으로 이끌어 내지 않으며 몇몇 배양 한 신경은 다른 사람 보다는 더 나은 종자 것을 주의 하는 것이 중요 합니다.

생체 내 α-syn PFF 모델의 또 다른 중요 한 특징은 몇 달에 걸쳐 출현 하는 뚜렷한 순차적 병리학 적 단계 이다. 설치류에서, 흉 골 내 주사 다음, α-syn 포함 형성은 일반적으로 SNpc 및 많은 대뇌 피 질의 영역 내에서 1-2 개월 이내에 피크. 이 응집 피크는 ≈ 2-4 개월 후에 니로 터의 변성에따른다. 이러한 뚜렷한 병리학 적 단계는 연구원에 게 1) α-syn 응집을 감소 시키는 전략을 연구 하 고 개발할 수 있는 플랫폼을 제공 하며, 2) 이미 형성 된 α-syn 개재 물 및/또는 3) 후속 신경 변성을 방지 합니다. PFF 모델은 이전에 검토 된 바와 같이 신경 독성, 형질 전환 및 바이러스 벡터 매개 α-syn과 발현 모델과 비교 하 여 뚜렷한 장점과 단점을 제공 한다⁶. 어떤 모델이 나 접근법을 선택 하는 것은 구도 자가 묻는 질문에 가장 적합 한 모델에 의해 결정 되어야 합니다.

PFF 모델은 많은 실험실에서 성공적으로 활용 되었지만, 섬유 소 생성 및 일관 된 α-syn 병리학의 생성과 불일치를 경험한 여전히 그룹이 있습니다. 불일치의 예로는 α-syn 병리학을 거의 또는 전혀 생성 하지 않는 PFFs의 범위, 회분 식 시 딩 시 효율성, 심지어 피 브 릴의 형성 실패 등이 있습니다. 따라서, α-syn PFF 생성 및 생체 내 적용의 표준화는 신규 한 치료 적 개입의 영향에 관한 정확한 해석을 허용 하기 위해 중요 하다. 다음의 프로토콜은 α-syn 단량체 로부터 PFFs의 생성에 필요한 단계를 간략하게 설명 하 고, PFFs의 시험관 내 품질 관리는 일단 형성 되 고, 사용 전에 PFFs의 초음파 처리 및 측정 하 고, 성공적인 생체 내 주입을 용이 하 게 하기 위한 제안 쥐 또는 마우스에 PFFs.

Protocol

동물을 포함 하는 모든 방법은 미시간 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다. 1. 모노 머 로부터 미리 형성 된 섬유 소의 α-시 뉴 클레 인 형성 (그림 1) Α-시 뉴 클레 인 단량체를 얼음에 해 동 하 고, 튜브를 쓸으 킴으로써 부드럽게 소생 하 고, 4°c에서 10 분 동안 15000 x g 에서 원심 분리 한다.주: α-syn 단량체는 섬유 화를 위해 특별히 제조 되어야 합니다. 재조합 단량체는 상업적 공급원 으로부터 구입 하거나, 사이트4,9,14,15에서 프로토콜에 의해 생성 될 수 있다. 상업적 공급원 으로부터 구입 하는 경우, 제품은 α-syn 단량체가 피 브 릴의 생성을 위한 것임을 명시 해야 합니다. 단량체를 현장에서 구매 하거나 생성 하는 경우에 관계 없이, 아래에 요약 된 품질 관리 단계는 각 배치를 수행 하 여 피 브 릴이 형성 되었는지 확인 하 고 실험에서 사용 하기 전에 효율적으로 시드해야 합니다. 상층 액을 깨끗 한 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에 옮기고 전송 된 양을 기록 합니다.참고: 펠 릿이 있는 경우, 작은 것을 방지 하기 위해 주의 하십시오. 표준 비 인산 성 분석 (BCA) 또는 마이크로 체적 분 광 광도 계로 280 nm에서 흡 광도를 측정 하 여 전달 된 상층 액의 단백질 농도를 측정 한다.참고: BCA 분석은 α-syn의 특정 측정에 대해 정확 하지 않으며 단백질 농도를 과도 하 게 예측 하는 결과를 얻을 수 있습니다. 그 결과, 280 nm에서 흡 광도를 측정 하는 것이 단백질 농도를 결정 하는 권장 방법입니다. BCA 분석 법을 사용 하 여 측정 하려면 표준 BCA 프로토콜을 따르고 α-syn 단량체의 세 가지 희석으로 수행 하십시오. 권장 희석 액은 1:25, 1:50 및 1:100입니다. A280 방법을 사용 하 여 측정 하려면 약 100 mM 염화 나트륨 및 pH 범위 7.0-7.3 (재료 표)의 염 농도가 있는 칼슘과 마그네슘이 없는 멸 균 1X Dulbecco의 인산 완충 식 염 수 (dpbs)를 사용 하 여 독자를 비워 두십시오. 판독기에 샘플 2 µ L을 추가 하 고 280 nm에서 흡 광도를 읽습니다. 단량체의 농도를 결정 하기 위해 맥주-램버트 법을 사용 합니다.참고: 인간 α-syn의 소멸 계수 ε는 5960 M-1cm이 고 마우스의 경우 α-1은 7450 m1입니다. 경로 길이는 cm 단위로 측정 됩니다. α-syn (14kda)의 분자량은 1 Da = 1g/mol을 가정 하 여 추정 된다. 1 배 dPBS로 단량체를 5 밀리 그램/m l의 최종 농도로 희석 하십시오. 아래의 방정식을 사용 하 여 단량체를 희석 시키기 위해 첨가 된 1x dPBS의 양을 계산 한다.참고: 모든 농도는 밀리 그램/m L에 있으며, µ l. 단량체 희석 액은 1x dPBS로 수행 해야 합니다. 피 브 릴을 생성 하는 데 사용 되는 총 부피는 100과 500 µ L 사이에서 재현 가능한 섬유 화 결과를 달성 해야 합니다. 간단히 소용돌이를 혼합 하 고, 원심 분리기는 튜브의 바닥에 모든 액체를 수집 한다. 1.8.1-1.8.4 단계에서 나타난 바와 같이 피 브 릴과의 품질 관리 비교를 위한 분 취 단량체. 튜브 록 또는 왁 스/플라스틱 필름 (재료 표)을 사용 하 여 마이크로 원심 분리기 튜브 뚜껑을 닫아 고정 하십시오. 37 ° c에서 7 일 동안 뚜껑을 덮은 궤도 열 혼합기에 튜브를 놓고 1000 RPM으로 흔들어 놓습니다 (재료 표).참고: 7 일이 끝날 때 튜브의 내용물은 혼 탁으로 나타나야 합니다. 써 모 믹서에는 튜브 뚜껑의 결로 형성을 막기 위해 뚜껑이 있어야 합니다. 튜브를 가볍게 쓸 어 서 α-syn 섬유를 소생 시킵니다. 1.8.1-1.8.4 단계에서 나타난 바와 같이 다음과 같은 품질 관리 단계에 대 한 분 취 섬유 소.참고: 품질 관리 단계를 위한 섬유 소는 밤새 RT에 저장할 수 있습니다. 침전 검정에 대 한 aliquot 6 µ L. Thioflavin T 결합 분석을 위한 µ L. 피 브 릴 시각화를 위한 투과 전자 현미경에 대 한 aliquot 2 µ L. 내 독 소 분석을 위한 적어도 10 µ L을 제공 한다.참고: 내 독 소 분석을 위해 상업용 투구게 Amebocyte 세포 용 해물 (랄)이 제조자의 지시에 따라 사용 됩니다 (재료 표). 내 독 소 수준은 피 브 릴에 대 한 ≤ 0.5 내 독 소 단위/m l 이어야 한다. 이 기준이 충족 되지 않으면 내 독 소 제거 키트를 사용할 수 있습니다. 남아 있는 섬유 소 및 저장. 장기 보관 (12-18 개월) 동안 드라이 아이스를 신속 하 게 동결 하 고-80 ° c에서 보관 하십시오.참고: 금액은 원하는 다운스트림 응용 프로그램에 따라 달라 집니다. 생체 내 사용은 전형적으로 시험관 내 사용 보다 높은 농도에서 더 많은 피 브 릴을 필요로 하 고, 취 입 부피는 그에 따라 계획 되어야 한다. 잠재적 동결/해 동으로 인 한 손상을 방지 하기 위해 섬유 소 뒤쪽으로 피 브 릴을 보관 해야 합니다. 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 2. 침전 분석 깨끗 한 마이크로 원심 분리기 튜브에서 54 µ L에 PFF의 6 µ L을 추가 하 여 섬유 소 1:10을 희석 하 고 혼합 할 수 있습니다. 별도의 튜브에, 추가 제어로 dPBS의 54 µ L에 단량체의 6 µ L을 추가 합니다. 시료를 RT에서 30 분 동안 1만 x g 에서 원심 분리 하 고 상층 액을 깨끗 한 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. DPBS의 60 µ L을 나머지 펠 렛과 소용돌이에 추가 하 여 소생 시킵니다. 각각의 튜브와 소용돌이에 30 µ L의 3 배 샘플 완충 액 (140 µ L의 50% 글리세롤/0.1% 브로 모 페 놀 청색, 40 µ L 및 β 진단을의 µ)을 첨가 하 여 혼합 한다. 시료를 100 ° c에서 10 분간 배양 하 고 얼음에서 5 분간 식혀 준다. 단백질 질량을 분리 하기 위해 표준 나트륨도 데 실 황산 폴 리 아크릴 아 미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 프로토콜을 사용 하십시오. 14 kDa (단량체 성 α-syn에 대해 예상 되는 크기 대역)을 포함 하는 범위의 단백질 사다리를 사용 하십시오. 겔을 염색 접시에 옮겨 넣고 겔을 Coomassie 블루 스 테 인 (0.1% Coomassie 브 릴리 언 트 블루, 20% 메탄올 부피로, ddH 2o의 부피로 10% 아세트산을 함유 합니다. 흔들어 주면서 RT에서 3 시간 동안 배양 합니다. Coomassie 블루 스 테 인을 부 어 충분 한 얼룩 (50% 메탄올 부피에 대 한 10% 아세트산 및 ddH 2o의부피 기준으로)을 추가 하 여 젤을 덮습니다. 흔들어 주면서 RT에서 30 분 동안 배양 합니다. 얼룩을 제거 하 고 젤이 선명 하 고 밴드가 보일 때까지 디 얼룩 단계를 반복 합니다. 젤을 3 회 5 분 동안 각각 ddH2에서 흔들어 젤을 이미지 하 여 세척 한다. 3. 피 브 릴 시각화를 위한 투과 전자 현미경 마이크로 원심 분리기 튜브에 우르 라 아세테이트 20 mg을 넣고 ddH2를 1 mL 첨가 하 여 2% 수 용액을 만듭니다. 우르 닐 아세테이트가 용액에 올 때까지 소용돌이가 밤새 앉을 수 있게 한다.참고: 우르 닐 아세테이트는 투과 전자 현미경의 샘플을 준비 하기 전에 하루에 이루어져야 합니다. 빛 또는 교 반에 노출 되 면 우 라 닐 아세테이트가 침전 될 수 있으므로, 우르 닐 아세테이트 용액을 포함 하는 튜브는 알루미늄 호 일로 덮여 야 하 고, 어두운 곳에 보관 하 고, 우 라 아세테이트가 용액 중에 흔들 리 지 않아야 한다. DPBS의 98 µ L에 PFF의 2 µ L을 추가 하 여 섬유 소 1:50을 희석 하 고 혼합 하십시오. 표면에 깨끗 한 왁 스/플라스틱 필름 (재질 표)을 준비 합니다 (약 50 mm x 50 mm). 클린 왁 스/플라스틱 필름 (재질 표)에 다음을 추가 합니다 (그림 2). DdH2의 4 x 10 µ l 방울을 추가 합니다. 희석 된 섬유 소 또는 모노 머 샘플 1 x 10 µ L 드롭을 추가 하십시오. 2% 우 라 닐 아세테이트 2 x µ L 방울을 추가 합니다. 미세 팁 집게를 사용 하 여 formvar/카본 코팅, 메시 구리 투과 전자 현미경 검사 표 (재료 표)를 선택 합니다.주: 중심에 있는 메쉬 부분을 피하 면 서만 모서리에 의해 그리드를 선택 해야 합니다 (그림 2a). 집게가 메쉬를 터치 하면 formvar/카본 코팅 필름이 손상 되어 그리드의 해당 영역에서 이미징이 불가능 합니다. 그리드 formvar/카본 코팅 면 (반짝이는 측면)을 ddH2의 첫 번째 방울 아래로 떠 놓습니다. 핀셋을 사용 하 여 그리드를 잡고 아래로 밀어 전체 코팅 표면이 ddh2와 접촉 하는지 확인 합니다. 그리드가 1 분 동안 떠 있게 하십시오. 그리드를 선택 하 고 그리드의 메쉬 부분을 건드리지 않고, 필터 종이로 ddH2를 심지를 멀리 합니다. DdH2의 두 번째 드롭에서 1 분 동안 위와 같이 그리드를 떠 서 ddh2o를 심지에 놓습니다. 1 분 동안 희석 된 피 브 릴의 방울에 그리드를 떠 서 위와 같이 초과 하는 심지를 멀리 합니다. 우 라 닐 아세테이트의 첫 방울에 격자를 떠 서 1 분 동안 과량으로 심지를 멀리 합니다. 우 라 닐 아세테이트의 두 번째 방울에 격자를 떠 서 1 분간, 과잉을 멀리 심지. DdH2의 세 번째 드롭에서 위와 같이 그리드를 짧게 떠 서 ddh2를 멀리 심지. DdH2의 네 번째 드롭에서 위와 같이 그리드를 짧게 부동 하 고 ddh 2를 제거하 고 가능한 한 ddh 2를 삭제 합니다. 이미징 할 때까지 스토리지에 대 한 그리드 상자로 전송.참고: 격자는 이미징 하기 전에 적어도 5 분 동안 건조 해야 합니다. 그리드는 준비 후 적어도 1 년 동안 이미징 할 수 있으며 건조 한 환경에서 보관 해야 합니다. 4. Thioflavin T 분석 깨끗 한 마이크로 원심 분리기 튜브에 PFF의 5 µ L을 추가 하 여 dPBS의 245 µ L을 첨가 하 여 섬유 소 1:50을 희석 하 고 혼합 하는 pipet. 250 µ L의 dPBS를 별도의 마이크로 원심 분리기 튜브에 추가 하 여 네거티브 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 245 µ L에 모노 머 5 µ L을 추가 하 여 모노 머 제어 역할을 합니다. 각 시료에 µ thioflavin의 글리신 버퍼 (25 µ의 thioflavin t, 100의 글리신, 1% 트리톤 X 100, pH 8.5)를 250 첨가 하 여 부드럽게 섞어 줍니다. Pipet 2 복제, 200 µ L 블랙 96 웰 플레이트에 각각. 광 표백을 방지 하기 위해 어둠 속에서 판을 유지 합니다. RT에서 1 시간 동안 배양 하 고 450 nm의 자극과 510 nm의 방출을 사용 하 여 플레이트를 읽습니다.참고: Thioflavin T 판독값은 시간이 지남에 따라 변동 됩니다. 샘플은 동일한 인큐베이션 시간에 읽어야 합니다. 원한다 면 시간에 따라 시간에 따른 인큐베이션 및 플로팅 동안 여러 판독값을 촬영할 수 있습니다. 5. 미리 형성 된 섬유 소의 α-시 뉴 클레 아의 초음파 처리 주의: 초음파 발생기 및 모든 초음파 처리 단계는 배양 후드에서 수행 되어 음파 처리 중에 공기 역학적 인 피 브 릴에 노출 되지 않도록 합니다. 초음파 처리 단계를 수행 하는 직원은 장갑을 낀 상태에서 장갑, 의류 보호를 비롯 한 개인 보호 장비를 착용 해야 합니다. 피 브 릴 노출의 위험은 컵 혼 초음파 분쇄기로 초음파 처리 하 여 감소 시킬 수 있으며, 섬유 소를 포함 하는 튜브가 수 광 중에 닫힌 상태로 유지 됩니다. 참고: 섬유 소의 최적의 초음파 매개 변수는 사용 되는 초음파 분쇄기의 모델에 따라 달라 집니다. 이러한 이유로, 일부 최적화는 피 브 릴이 올바른 크기를 보장 하기 위해 수행 해야 합니다. 사용 되는 초음파 분쇄기는 재료의 테이블 에서 찾을 수 있으며, 설명 된 매개 변수는 초음파 분쇄기의이 모델로 이전 결과를 기반으로 합니다. 아래의 매개 변수는 200-400 µ L의 PFFs의 2-4 µ g/µ L에 대해 작동 합니다. 실험에서 PFFs를 사용 하기 전에 원하는 결과를 달성 하기 위해 계측기와 함께 테스트 초음파 처리를 수행 하 고 피 브 릴을 분석 해야 합니다. 변환기에 3.2 mm 직경 프로브 (재료 표)를 부착 하 고 5.1.1-5.1.3 단계에서 아래에 언급 된 초음파 발생기 매개 변수를 설정 하십시오. 진폭을 30%로 설정 합니다. 펄스를 01 01 (1 초)로 설정 합니다. 시간을 0:01:00으로 설정 합니다.참고: 펄스의 1 분은 60 펄스와 동일 하 고, 초음파 분쇄기 (재료의 테이블)이 모델은 자동으로 중지 됩니다. 다른 초음파 발생기 모델과 함께, 펄스의 수를 계산 해야 합니다. 배양 후드에 멸 균 된 dPBS로 희석 하 여 RT에서 섬유 소를 해 동 한다.참고: 명확한 0.6 mL 마이크로 원심 분리기 튜브는 초음파 처리에 가장 적합 하며 최종 피 브 릴 농도는 사용 목적에 따라 달라 집니다. 대표적인 결과는 4 µ g/µ L의 최종 피 브 릴 농도 로부터 나타난다. 초음파 발생기의 프로브를 70% 에탄올로 적신 실험실 조직으로 닦아 프로브를 청소 하십시오. 프로브 팁을 ddH 2o 및 펄스 10배로 세분화 하 여 프로브를 더 청소 한 다음 실험실 티슈로 닦아 내 세요. 희석 된 피 브 릴 튜브에 프로브 팁을 놓고 튜브 하단에 팁을 놓습니다. 60 펄스에 대해 초음파 처리 (1 초) 각 펄스 중에 프로브를 위아래로 움직여 액체의 모든 섬유 소를 초음파 처리 하십시오. 깨끗 합니다. 60 펄스 후, pffs에서 프로브를 제거 하 고 깨끗 한 마이크로 원심 분리기 튜브에 dpbs의 pffs 2 µ l 98을 추가 하 여 전자 현미경으로 초음파 처리 된 섬유 소 1:50을 희석 합니다.참고: 이상적으로는 생체 내 주입 이전에 피 브 릴의 작은 부분 집합을 측정 해야 하며 시간이 허락 될 때 수행 되는 섬유 소를 보다 포괄적으로 측정 합니다. 초음파 처리 후, 튜브의 측면에서 모든 액체를 수집 하기 위해 2000 x g 에서 1 초 동안 짧게 원심 분리기 pffs.주의: 튜브가 뜨거워 지 면 30 펄스 후 초음파 처리를 멈추고 1 분 동안 기다린 후 최종 30 펄스에 대해 초음파 처리 하십시오.참고: 초음파 처리 하는 동안 각 펄스의 시작에서 프로브 팁을 액체의 맨 아래 쪽으로 유지 하면 액체의 상단에 너무 가깝게 샘플 손실이 발생 합니다. 프로브 팁을 1% SDS 및 펄스 10 번으로 세분화 하 여 프로브를 청소 합니다. SDS에서 팁을 제거 하 고 ddH 2o 및펄스 10 번에서 서브 머지 하십시오. 70% 에탄올로 적신 실험실 티슈로 프로브를 닦은 다음 건조 한 실험실 조직으로 프로브를 닦습니다. 컨버터 및 저장소에서 프로브를 분리 합니다. 1% SDS로 후드의 모든 표면을 닦아 낸 다음 70%의 에탄올을 제거 합니다.참고: 1% SDS 용액은 섬유 소를 해리 하 고 깨끗 한 표면과 장비16을 사용 합니다. 6. 초음파 처리 된 섬유 소 측정을 위한 투과 전자 현미경 참고: 전자 현미경 검사를 할 수 없는 경우, thioflavin T 역학 분석 및 동적 광산 란은 시드 효율 및 피 브 릴 크기4의 간접 측정으로 사용 됩니다. 위의 “전자 현미경 검사 법” 섹션에서 프로토콜을 사용 하 여 샘플을 준비 합니다. 투과 전자 현미경을 사용 하 여 6 ~ 10 개의 다른 그리드 개 구 부 로부터 피 브 릴의 이미지를 촬영 합니다.참고: 이미지는 피 브 릴을 측정 하기에 충분 한 배율로 해야 하지만 여러 개의 피 브 릴을 동시에 시각화할 만큼 낮습니다. 약 75, 000x의 최종 배율은 충분 해야 합니다. 실험에서 피 브 릴을 사용 하기 전에 적어도 25 소의 작은 하위 세트의 길이를 측정 합니다.참고: 이러한 측정은 일반적으로 현미경과 관련 된 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 수행 될 수 있습니다. 빠른 검증을 위해 측정 자가 대표 섬유 소를 선택 하 고 평균 크기를 계산 해야 합니다. 피 브 릴 길이는 평균 약 50 nm이 하 이며, 보다 정확한 측정을 수행 해야 합니다. 보다 포괄적인 결과를 위해 500 개 이상의 피 브 릴의 길이를 측정 합니다.참고: 현미경과 관련 된 이미징 소프트웨어는 피 브 릴 측정에 사용할 수 있습니다. 대안적으로, 이미지는 각 이미지와 연관 된 스케일 바를 사용 하 여 피 브 릴 길이를 비교 하는 크기 참조로 서, 화상 처리 소프트웨어로 측정 된 피 브를 열 수 있다. 7. 정위 주사를 위한 맞춤형 유리 바늘 주사기의 준비 (그림 3) 약 10ml의 규소 화 시 약 (재료 표)을 깨끗 한 50 ml 비 커에 추가 합니다. 장소 유리 모 세관 (길이 54 mm; 외경: 0.86 0.59 mm) 규소 화 시 약의 비 커를 수직으로 하 고 모 세관 작용이 가능 하 여 튜브를 위쪽으로 하 부 관 개 구를 통해 규소 화 시 약을 그려 규소 화 시 약. Pipet는 유리 모 세관 튜브를 완전히 채울 수 있도록 규소 화 시 약에 침수 되지 않는 상부 관 개 구 부에 실리 카를 추가 합니다. 규소 화 시 약에서 모 세관을 제거 하 고 튜브에 있는 튜브의 열린 끝 부분을 종이 타월에 블 롯 하 여 실리 카를 제거 합니다. 모세 혈관을 8 시간 이상 건조 시키십시오. 유리 바늘 풀러 (재료의 테이블)에 규소 화 된 유리 모 세관을 놓습니다. 발열 체를 켜고 연결 된 분 동을 허용 하 여가 열 된 유리 모 세관을 늘입니다. 중간에 가장 얇은 지점에서가 위로 당겨 유리 모 세관을 절단 하 고 유리 바늘 풀러에서 유리 바늘을 제거 합니다.참고: 당기는 바늘 안쪽과 바깥쪽 지름은 각각 약 80 및 100 µm 해야 합니다. 여러 개의 유리 바늘은 한 번에 만들 수 있으며 부착 된 금속 바늘 (재료의 테이블)와 유리 주사기에 부착 할 준비가 될 때까지 저장. 가 위로 약 40 mm까지 수축 포장 튜브 (평균 내경 0.021 “및 평균 벽 두께 0.001”)의 길이를 잘라. 10 µ L 베벨 주사기 (재료 표)의 금속 바늘 위로 수축 포장을 밉니다. 열을 사용 하 고 열을 균일 하 게 열을 적용 바늘을 회전 하는 동안 바늘에 수축 포장을 준수 합니다. 당겨 지는 유리 바늘의 큰 끝을 주사기의 금속 바늘 위로 조심 스럽게 밉니다. 수축 포장 튜브 (평균 내경 0.036 “및 평균 벽 두께 0.005”)를가 위로 약 40 mm까지 절단 하 고 유리 바늘과 주사기의 금속 바늘의 기저 부분에 겹쳐지도록 세 심하게 슬라이드 합니다 (표 재료). 유리 바늘을 금속 바늘에 고정 시키기 위해 열기 불꽃을 사용 하 여 수축 포장을가 열 합니다. 유리 바늘을 고정 하기 위해 추가 수축 포장 층을 추가 하십시오. 수축 포장 튜브 (평균 내경 0.044 “및 평균 벽 두께 0.005”)를가 위로 약 40 mm까지 절단 하 고 유리 바늘과 주사기의 금속 바늘의 기저 부분에 겹쳐지도록 세 심하게 슬라이드 합니다 (표 재료). 유리 바늘을 금속 바늘에 고정 시키기 위해 열기 불꽃을 사용 하 여 수축 포장을가 열 합니다. 끝이 약 8mm 길이 되도록가 위로 유리 바늘을 자릅니다.참고: 바늘은 원하는 뇌 영역을 대상으로 충분히 오래 해야 합니다 (필요한 길이는 등 쪽/복 부 좌표에 따라 다름). 7.14.1-7.14.3 단계를 사용 하 여 바늘을 테스트 하 여 누출이 없는지 보장 하 고 유리 바늘에서 액체를 인출 하 고 분배 하는 데 충분 한 흐름이 있습니다. 1ml 주사기를 부착 된 26 게이지 바늘에 dH2O를 채웁니다. 사용자 정의 유리 바늘 주사기에서 금속 플런저를 제거 하 고 dH2의 바늘을 주사기의 기저 부에 삽입 합니다. 유리 바늘에서 dH2o를 분배 하는 압력을 적용 합니다. 유리 바늘과 금속 바늘의 인터페이스를 검사 하 여 누출을 확인 하 고 안정적인 dH2O 흐름을 확인할 것입니다.주: 필요 하다 면 유리 바늘은 유리 바늘의 바닥에서 누출을 패치 하기 위해 추가 된 수축 포장의 흐름 및 추가 층의 용이성을 높이기 위해 손질 할 수 있습니다. 마이크로 원심 분리기 튜브를 dH2o로 채웁니다. 사용자 정의 유리 바늘 주사기를 사용 하 여 dh2를 그립니다. 바늘을 검사 하 여 액체가 주사기로 들어가 있는지 확인 하 고 거품이 없습니다.주: 거품 또는 dH2가 바늘에 그려지지 않는 경우, 바늘을 트리밍하면 압력을 완화 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 수술을 위해 필요할 때까지 주사기 상자에 유리 바늘이 부착 된 주사기를 조심 스럽게 보관 하십시오. 마우스의 최적화 된 좌표에서 PFFs의 내 분 전달에 대 한 표준 입체 수술 방법을 사용 하십시오 (1 부: AP + 0.2 mm, 듀 라에서의 DV-2.6 mm) 또는 쥐 (두 사이트: AP + 1.6 mm와 ML + 2.0에서 2.0) 0.1, DV-5.0의 bregma에서의 AP + 4.2 mm,17.참고:이 좌표는 C57BL6/C3H 마우스 및 피셔 344 쥐에서 사용 되었습니다. 다른 변형을 사용 하는 경우 좌표를 최적화 해야 합니다.

Representative Results

Α-syn 단량체 로부터의 소 섬유의 생성은 단량체의 농도를 결정 하는 것으로 시작 한다. BCA 분석 및 280 nm (A280)에서 흡 광도의 측정은 단백질 함량을 측정 하는데 사용 될 수 있다; BCA 분석 결과는, 그러나, A280 방법 보다는 더 높은 농도를 제안 했습니다. 마우스 α-syn 단량체 로부터 유도 된 PFFs는 14.05 ± 0.22의 BCA 값을 가지 며 8.05 ± 0.03 µ µ L의 A280을 가졌다 (도 1). 마찬가지로, 인간 α-syn 단량체 로부터 유도 된 PFFs도 높은 농도에서 12.95 ± 0.38의 BCA 값과 7.83 ± 0.05 µ µ L의 A280으로 나타났다 (도 1). A280 측정은 소멸 계수의 포함에 기초 하 여 α-syn에 특이 적 이며 이러한 결과는 7 일 인큐베이션 전에 단량체를 희석 시키기 위해 사용 하였다. 인큐베이션 전에, α-syn 단량체를 포함 하는 액체는 분명 하지만, 피 브 릴 형성 후에 혼 탁 하 게 나타나야 한다. 투과 전자 현미경 검사는 10-20 nm 폭을 측정 한 긴 섬유 소의 존재를 확인 했습니다 (그림 4). 이에 비해 α-syn 단량체는 겉보기에 눈에 띄지 않는 모양으로 보이지 않았다 (그림 4). Fibrillar 구조에 대 한 시각적 확인을 통해, 피 브 릴의 아 밀 로이드 형태는 thioflavin T 검정을 사용 하 여 확인 해야 하는 PFFs의 다음 기능입니다. Thioflavin T는 아 밀 로이드에 결합 될 때 향상 된 형광을 나타낸다; 따라서, 샘플 로부터의 증가 된 형광 신호는 아 밀 로이드의 존재를 나타낸다. 일례로 서, dPBS는 3287 ± 580의 상대 형광 단위 (RFU)의 신호를 생성 하 고, 마우스 α-syn 단량체는 4174 ± 158 RFU의 신호를 생성 하 고, 마우스 PFFs에는 59754 ± 6224 RFU의 신호를 thioflavin 하였다 (도 5). 이와 비교 하 여, 인간 α-syn 단량체는 마우스 모노 머에 4158 ± 105 RFU의 유사한 신호를 생성 하 고, 휴먼 PFFs는 마우스 PFFs에 비하여 1235967 ± 113747 RFU의 높은 신호를 생성 하였다 (도 5). 펠 렛 테이블 섬유 소의 존재를 평가 하기 위해 침전 분석을 수행 하였다. 소 릴은 원심 분리로 펠 렛을 합니다. 마우스 및 인간 PFF 샘플 모두에서, 상층 액 분 획 물은 상 등 액 보다 펠 렛에 더 많은 단백질을 가져야 한다 (도 6). 대조적으로, 대부분의 마우스 및 인간 단량체 로부터의 단백질은 펠 렛 내에 거의 존재 하는 상 청 액에 존재 하였다 (도 6). PFFs가 전자 현미경, 아 밀 로이드 구조 존재 및 피 브 릴 펠 렛 테이블에 의해 가시적으로 존재 하는 PFFs는 모든 시험관 내 품질 관리 단계를 통과 시켰다. 마우스 및 인간 pffs 모두는 α-syn 개재 물4,18의 시드를 위한 적절 한 길이의 pffs를 생성 하도록 초음파 처리 되었다. PFFs는 4 µ g/µ L의 원하는 농도로 희석 하 고 초음파 처리 하였다. 수술 직전에, 25 개 대표적인 피 브 릴을 전자 현미경으로 이미지화 하 고 피 브리 실 크기를 스폿 체크 하는 것으로 측정 하였다. 초음파 처리 된 마우스 PFFs는 48.8 ± 3.1 nm를 측정 하는 반면, 인간 PFFs의 길이는 52.1 ± 4.4 nm 이다. 두 종의 PFFs는 따라서 적절 한 길이 (50 nm이 하)가 시드 활성을 유도 하였다. 약 500 섬유 소의 보다 포괄적 인 검사는 초음파 처리 된 마우스 섬유 소의 평균 길이 및 길이 분포를 밝혀 내었다. 평균 길이는 44.4 ± 0.6 nm이 고, PFFs 측정의 86.6%는 60 nm이 하 이다 (그림 4). 이에 비해, 휴먼 pffs의 평균 55.9 ± 1.1 nm 미만의 69.6%의 pffs 60 측정을 하였다 (도 4). 앞서 설명한 바와 같이 쥐에 초음파 처리 된 마우스 pffs의 내분 비 주입 후,5, 일련의 조직 절편을 2 개월 후에 수술 후, 신경 세포를 포함 하는 포함의 수가 피크로 알려져 있는 경우 SNpc는 인 산화 된 α-syn 개재 물의 확인을 위해5. 포함 베어링 뉴런은, pSyn ( 물질의 테이블에 있는 항 체)에 대 한 면역 조직 염색에 의해 지시 되는 바와 같이 Snpc (도 7) 내에 존재 하 고, 뿐만 아니라 다른 지역 들을 신경 자극 하는 뇌를 통하여 (전방 후 각 핵, 모터, 대뇌,이 상근, prelimbic, 체 감각, entorhinal 및 인 술 관 류, 복숭아 류, 편도,19. 이러한 개재 물 들이 면역 조직 화학 염색 ( 물질의 테이블에 있는 항 체 및 프로 테이 나 제 k)에 의해 나타낸 바와 같이, thioflavin의 결합, 및 프로 테이 나 제 k에 대 한 총 α-syn과 같은 lewy 체와 유사한 성질을 공유 한다 (도 7) . 뇌 내에서의 시 딩의 확인은 생체 내 품질 제어가 통과 되었으며, 동일한 배치 로부터 이전에 동결 되 고 저장 된 PFFs의 분 취 액은 동일한 매개 변수 하에서 초음파 처리 될 수 있으며, 길이는 더 큰 실험에서 검증 됩니다. 그림 1 . Α-syn 섬유 소의 생성을 위한 방법. Α-syn 단량체 로부터 섬유 소를 생산 하는 데 필요한 단계의 윤곽. 단량체는 10 분 (15000 x g, 4°c에서) 동안 원심 분리 된다. 상 청 액은 깨끗 한 튜브로 이송 되 고 단백질 농도는 280 nm에서의 흡 광도 또는 BCA 분석 법에 의해 결정 된다. 그래프는 인간 및 마우스 α-syn 단량체의 농도를 나타낸다. 열은 그룹 평균을 나타내며 오차 막대는 평균의 ± 1 표준 오차를 나타냅니다. 단백질 농도가 결정 된 후에, α-syn 단량체는 1000 RPM으로 설정 된 궤도 혼합기 상에 서 흔들어 주면서, 37 ° c에 대 한 간단한 보 텍 싱 및 7 일 동안 인큐베이션 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 . 투과 전자 현미경에 대 한 염색 방법. 전자 현미경에 대 한 부정적인 얼룩의 다이어그램. A) 전자 현미경 견본 격자를 묘사 하는 심상. 그리드는 무딘 또는 밝은 측면과 반짝 또는 어두운 면이 있습니다. 광택/어두운 면은 formvar/카본 지지 필름으로 코팅 되어 있습니다. B) 염색 절차의 그림. 격자는 1 분 동안 ddH2의 첫 번째 방울에 반짝/어두운 면이 아래로 떠 있고 과량은 여과 지에서 사악 합니다. 이 공정은 ddH2, 희석 된 pffs 또는 단량체의 두 번째 방울, 우 라 닐 아세테이트 2 방울이 함께 반복 되며, ddh2의 추가 방울은 이미지 될 때까지 그리드 박스에 저장 될 수 있다. 스케일 바 = 3mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 . 사용자 정의 유리 바늘 주사기의 조립. 유리 바늘 부착 주사기를 조립 하는 데 필요한 단계의 다이어그램. 규소 화 유리 모 세관은 유리 바늘을 생산 하는 중간에 뽑아 절단 된다. 수축 포장 튜브는 금속 바늘을 준비 하 고 유리 바늘이 금속 바늘에 슬라이딩 될 때 내부 씰을 형성 하는 데 사용 됩니다. 유리 바늘과 금속 바늘의 염기와 겹치는 수축 포장 튜브의 2 개의 추가 층이 연속적으로 첨가 되 고 열이가 해지면 유리 바늘을 고정 하 고 방수 밀봉을 형성 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4 . 투과 전자 현미경을 통한 α-syn 단량체 및 α-syn 섬유 소의 가시화 . Α-syn 단량체 및 소 섬유의 대표적인 마이크로 그래프. 상단 패널: 마우스 및 인간 α-syn 단량체. 중간 패널: 전체 길이 마우스 및 인간 α-syn PFFs. 하단 패널: 초음파 처리 후 마우스 및 인간 α-syn PFFs. 하단 그래프: 초음파 처리 된 마우스 및 인간 α-syn 길이의 분포. 스케일 바 = 500 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5 . Thioflavin T 분석에의 한 아 밀 로이드 구조의 확인. 마우스 및 인간 α-syn 단량체 및 PFF 샘플 로부터의 형광 신호 측정. 왼쪽: 마우스 α-syn 단량체 및 α-syn PFFs의 결과. 오른쪽: 인간 α-syn 단량체 및 α-syn PFFs의 결과. DPBS 네거티브 컨트롤은 각 그래프에 표시 됩니다. 모든 측정은 상대 형광 단위 (RFU)로 표현 됩니다. 열은 그룹 평균을 나타내며 오차 막대는 평균의 ± 1 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 6 . 펠 렛 테이블 α-syn에 대 한 침전 분석 . 코 마 시디 스테인드 젤의 이미지. 표시 된 밴드는 단백질 사다리를 기준으로 약 14 kDa입니다. 왼쪽: 마우스 모노 머와 PFFs. 오른쪽: 인간 단량체 및 PFFs. 모든 단량체 및 PFF 샘플에 대해, 재현 탁 펠 렛 (P) 및 상 등 액 (들)이 도시 되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 7 . Α-syn 병리학을 확인 하는 쥐 모델의 개재 물 특징. Compacta에서의 대표적인 마이크로 그래프는 2 개월 후 주입 후에는 니 그 라 파스를 통해 서 나타난다. 왼쪽: pSyn을 포함 하는 뉴런 및 cresyl 바이올렛으로 반격. 중간: Thioflavin S 양성 뉴런. 오른쪽: α-syn 함유 프로 테이 나 제 k. 스케일 바에 내성 = 50 µm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

뉴런을 시드 할 수 있는 α-syn PFFs의 생산과 Lewy 바디와 같은 개재 물로 이어지는 것은 여러 요인 및 단계에 따라 달라 집니다. 중요 한 요인은 섬유 소를 생성 하는 데 사용 되는 단량체가^4,9,14,15에 대 한 구체적으로 공식화 될 필요가 있다는 것 이다. 모노 머가 섬유 화를 위해 공식화 되지 않는 경우에, 피 브 릴은 형성 되지 않거나 형태를 이루는 섬유 소는 α-syn 병리학을 생성 하지 않을 수 있습니다. 마찬가지로, 단량체가 있는 완충 액도 섬유 화에 영향을 미친다. 이와 같이, 최상의 결과를 위해, 염 농도는 7.0 및 7.3 사이의 약 100 mM 염화 나트륨 및 pH 이어야 한다. 변동성을 소개 하는 초기 단계는 초기 단백질 함량이 결정 되는 방법 이며, A280에서의 측정은 보다 정확한 결과를 생성 할 가능성이 있으므로 선호 되는 방법입니다. 단백질 농도의 불일치는 피 섬유 화 공정의 효능을 저하 시킬 수 있을 뿐만 아니라 실험에 사용 되는 가정 된 PFF 농도를 변경할 수도 있다. 둘 다 실험 간의 시드 효율성과 배치 변이의 감소로 이어질 수 있습니다.

초기 품질 관리 단계는 PFFs의 중요 한 특징을 확인 하 고 (전자 현미경) 아 밀 로이드 구조 (thioflavin T 분석)를 포함 하 고 펠 렛 테이블 (침전 분석)입니다. Thioflavin T 검정의 결과는 시간에 따라 변동 하 고 존재 하는 아 밀 로이드 구조물의 양의 직접적인 측정이 아니라는 것을 주의 하는 것이 중요 합니다, 오히려, thioflavin T 분석은 내에서 아 밀 로이드 구조 존재의 지표로 서만 사용 되어야 합니다 샘플입니다. Thioflavin T는 통상적으로 상기 피 브리 스가 아 밀 로이드 구조를 함유 하는 것을 보여주기 위해 전술한 검정 법과 같은 시험관 내 분석에 사용 된다. 대안적으로, thioflavin S는 도 7에 도시 된 바와 같이 아 밀 로이드 구조를 검출 하기 위해 조직에서 사용 된다. 침 강 분석에 관해서, 결과는 PFFs가 펠 렛 테이블 분 획에서 주로 발견 되는 것만을 보여준다. 샘플이 변성 조건에서 실행 되기 때문에 α-syn 단량체의 크기 인 약 14 kDa의 단일 눈에 띄는 밴드가 젤에 존재 합니다. 이것은 기본 또는 비 변성 젤을 사용 하는 경우 PFFs에 예상 되는 더 높은 분자량에 존재 하는 다중 밴드와는 달리입니다. 마지막으로, 이러한 모든 초기 품질 관리 단계를 성공적으로 통과 하는 것은 α-syn 포함 시드 작업을 보장 하지 않습니다. 이러한 이유로, 세포 배양 실험 또는 외과 적 주사 동물의 작은 집단은 큰 실험에서 사용 하기 전에 PFFs의 효능을 시험 하기 위해 사용 되어야 한다.

초음파 처리는 공정에서 중요 한 단계 이며 매개 변수는 사용 되는 초음파 분쇄기의 모델에 따라 다를 것입니다. 초음파 매개 변수를 적용 하 고 짧은 PFF 조각이 생성 되었음을 보여주기 위해 확인 해야 합니다. 피 브 릴 크기는 파 종에 베어링이 있으며, 짧은 섬유 소를 더 효율적으로 시 딩 합니다. 짧은 섬유 소는 더 효율적으로 종자 이지만,이 효과 고원 및 최적의 pff 길이는 약 50nm 이다. 샘플을 지나치게 초음파 처리 하 고 PFFs에 과도 한 열을 노출 하지 않는 것도 중요 합니다 .이는 시드 효율을 저하 시킬 수 있습니다. 이러한 초음파 처리 된 PFFs는 대규모 실험에서 사용 하기 전에 작은 세포 배양 또는 생체 내 실험에서의 효능에 대해 시험 되어야 한다. 다른 초음파 세션은 가변성을 소개 할 수 있는 잠재력을가지고 있기 때문에 실험적 치료 그룹을 계획 해야 합니다.

Pffs를 생체 내에서 전달 하는 경우, 주사 부위 (들) 및 사용 된 총 양의 pffs의 국 소화는 신경 변성^7,14의 정도 뿐만 아니라 개재 물을 개발 하는 뉴런의 수에 영향을 미칠 수 있다. 프로토콜의 좌표는 시작 하는 장소를 제공 하지만, 대규모 실험에서 사용 하기 전에 원하는 표적 지역이 α-syn 병리학을 개발 하도록 하기 위해 실험실 내에서 테스트 되어야 합니다. 원한다 면, 추적 염료 또는 형광 구슬 PFFs를 사용 하기 전에 지역 타겟팅을 테스트 하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 생체 내에서 사용 되는 pffs의 양은 그룹 마다 다르며, 대부분의 그룹은 pffs의 5 ~ 20 µ g 사이에 총을 사용 하 여 2 개의 주사 부위^{1,2, 3},⁵ 사이에서 나누어 ^{, 6 , 7 , 14}. 주사 사이트의 수, 주사 부의 위치, 주입 된 pffs의 양은 시 핵 병의 결과 및 진행 성에 영향을 미칠 수 있으므로, 사용 되는 파라미터의 다운스트림 결과는 모델을 사용 하기 전에 특성화 되어야 잠재적인 개입을 테스트 하거나 모델의 임시 기능을 검사 합니다.

치료법을 시험 하거나 질병 진행을 연구 하는 데 사용할 모델을 선택할 때, 사용 된 모델을 선택 하 여 질문에 가장 잘 대답 합니다. 모든 모델이 PD의 특정 질병 기능을 소유 하거나 잠재적인 개입을 테스트 하는 데 필요한 기간을 제공 하지는 않습니다. PFF 모델은 α-syn 병리학 및 신경 퇴행과 같은 PD의 주요 특징을 탈환 하며, 겸손 한 운동 장애로 이어질 수 있습니다. 이 모델은 예측 가능 하 고 일정 한 시간 과정을 제공 하며, 신경 변성을 위해 몇 달 동안 개재 물이 형성 됩니다. 이를 통해 연구원은 시 핵 병의 진행 과정 전반에 걸쳐 여러 단계를 검토 하 고 악용할 수 있습니다. 전반적인 모델의 현재와 미래의 사용은 질병 진행 및 새로운 치료법의 개발에 도움이 될 것으로 예상 된다.

Materials

1x Dulbecco’s phosphate buffered saline	Thermo Fisher (Gibco)	14190144
Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody	Abcam	AB184674
Anti-alpha-synuclein antibody	Abcam	AB15530
Bicinchonic acid	Thermo Fisher (Pierce)	PI23228
Clear Medical Shrink Tubing (0.036″ inner diameter)	Nordson Medical	103-0143
Clear Medical Shrink Tubing (0.044″ inner diameter)	Nordson Medical	103-0296
Copper sulfate	Thermo Fisher (Pierce)	PI23224
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf	2231000574
Eppendorf ThermoTop heated lid	Eppendorf	5308000003
Formvar/Carbon coated electron microscopy grids	Eletron Microscopy Sciences	FCF300-Cu
Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length)	Drummond	22-326223
Glass needle puller	Narishige	PC-10
Hamilton syringe	Hamilton	80000
Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils	Proteos	RP-003
Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils	Proteos	RP-009
Orange Medical Shrink Tubing (0.021″ inner diameter)	Nordson Medical	103-0152
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7543
Proteinase K	Invitrogen	25530015
Qsonica 3.2 mm tip	Qsonica	4422
Qsonica Q125 sonicator	Qsonica	Q125
Thioflavin S	Sigma-Aldrich	T1892
Thioflavin T	EMD Millipore	596200
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit	Genscript	L00350C
Uranyl acetate	Eletron Microscopy Sciences	22400