ビブリオ・フィシェリ・アイシス間の競争的相互作用を定量化するためのコインキュベーション・アッセイ
Summary
細菌は、細菌間の競争に従事するための多様なメカニズムをコードします。ここでは、細菌単離物間の競合相互作用を特徴付け、それらが混合集団の空間構造にどのように影響するかを特徴付ける培養ベースのプロトコルを提示する。
Abstract
この原稿は、2つの細菌集団間の競合相互作用を検出し特徴付けるための培養ベースのコインcubationアッセイについて説明する。この方法は、各集団の選択と視覚的判別のための明確な抗生物質耐性能力と蛍光タンパク質をそれぞれ差別化してタグ付けすることを可能にする安定したプラスミドを採用しています。ここでは、競合するビブリオ・フィシェリ株の調製とコインキュベーション、蛍光顕微鏡イメージング、および定量データ解析について説明する。このアプローチは簡単で、迅速な結果をもたらし、ある集団が別の集団の増殖を殺すか阻害するか、また、競合が拡散性分子を介して媒介されるか、または直接細胞間接触を必要とするかを決定するために使用することができます。各細菌集団は異なる蛍光タンパク質を発現するので、アッセイは混合コロニー内の競合する集団の空間的な判別を可能にする。記載された方法は、この種に最適化された条件を用いて共生細菌V.fischeriで行われるが、プロトコルは、ほとんどの培養可能な細菌単離物に適応することができる。
Introduction
この原稿は、2つの細菌単離物が競合相互作用が可能であるかどうかを決定する培養ベースの方法を概説する。混合集団を研究する場合、細菌単離物がどの程度相互作用するか、特に分離分離が干渉メカニズムを介して直接競合しているかどうかを評価することが重要です。干渉競争とは、1 つの集団が直接成長を阻害したり、競合する集団1を殺したりする相互作用を指します。これらの相互作用は、微生物コミュニティの構造と機能2、3に大きな影響を及ぼす可能性があるため、識別することが重要です。
微生物競争のメカニズムは、宿主関連細菌と自由生殖細菌4、5、6、7、および両方を含む多様な環境からの細菌のゲノムで広く発見されている。 8,9.殺菌化学物質1、12、分泌抗菌ペプチド13などの拡散性メカニズムを含む様々な競争戦略が記載されている10、11 阻害エフェクターを標的細胞に移すために細胞接触を必要とする接触依存性機構と同様に、9,14,15,16,17 、18.
培養ベースのコインキュベーションは微生物学5、8、19で一般的に使用されていますが、この原稿は、アッセイを使用して競争のメカニズムを特徴付ける方法と適応のための提案を概説しています。他の細菌種と使用するためのプロトコル。さらに、この方法では、競合インタラクションの性質に関するさまざまな質問に答えるために、データを分析および提示するための複数のアプローチについて説明します。ここで説明する技術は、以前にコビオビブリオ・フィシェリ属細菌19の共生性対称的競争の根底にある細菌間殺菌機構を同定するために用いられたが、それらは、それらのために適している環境分離物およびヒト病原体を含む多くの細菌種は、接触依存性および拡散性の両方の競争メカニズムを評価するために利用することができる。プロトコルのステップは、他の細菌種の最適化を必要とする場合があります。より多くのモデルシステムが異なる種型10、16、20、21を含むように同種生物の使用を超えて研究を拡大していることを考えると、この方法は貴重な資源となるでしょう。競争が多重株や多種系に与える影響を理解しようとする研究者のために。
Protocol
1. コインキューベーション用の菌株を準備する コインベキュートアッセイ中に細菌競争の標的となる適切な基準株を選択します。参照ひずみの選択時のベスト プラクティスと、参照ひずみが結果に与える影響については、「ディスカッション」を参照してください。このプロトコルでは、V.fischeri株ES114が基準株として機能する。 コインの中の分離物…
Representative Results
細菌集団間の競合相互作用を評価するために、V.fischeri用に最適化されたコインcubationアッセイプロトコルが開発され、最適化された。この方法は、抗生物質耐性遺伝子および蛍光タンパク質をコードする安定したプラスミドを利用し、各株の差異選択および視覚的判別を可能にする。コインベーションアッセイから収集したデータを分析することで、相互作用?…
Discussion
上記のコインcubationアッセイは、細菌間の競合を発見するための強力な方法を提供する。このアプローチは、V.fischeri分離と競争メカニズム19の特性特性間の特異的競争の同定を可能にした。記載された方法は海洋細菌V.フィシェリ用に最適化されたが、臨床および環境分離を含む他の細菌種に対応するように容易に改変することができる。競争メカニズムは、多…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、彼らの有用なフィードバックのためのレビュー担当者に感謝したいと思います。A.N.S.は、ライフサイエンス研究財団への助成金GBMF 255.03を通じてゴードンとベティムーア財団によって支援されました。
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 μL multichannel pipette | |||
| 100 μL multichannel pipette | |||
| 300 μL multichannel pipette | |||
| 10 μL single channel pipette | |||
| 20 μL single channel pipette | |||
| 200 μL single channel pipette | |||
| 1000 μL single channel pipette | |||
| 24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
| 96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
| Calculator | |||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
| Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
| forceps | Fisher | 08-880 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
| Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
| petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
| Spectrophotometer | |||
| Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
| TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
| TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
| Vortex | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LBS media | |||
| 1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
| DI water | 950 mL | ||
| Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
| Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
| Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
Referências
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
- Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
- Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
- Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
- Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
- Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
- García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
- Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
- Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
- Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
- Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
- Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?. Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
- Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
- Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
- Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
- Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
- Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
- Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
- Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
- Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
- Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
- Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
- Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
- Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
- Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).
Citar este artigo
Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).