Bruk av Alu Element som inneholder minigenes å analysere sirkulære RNAs
Summary
Vi klone og analyserer reportergener som genererer sirkulære RNAer. Disse reportergenene er større enn konstruksjoner for å analysere lineær spleising og inneholder Alu-elementer. For å undersøke de sirkulære Rna-ene blir konstruksjonene overført til celler, og resulterende RNA analyseres ved hjelp av RT-PCR etter fjerning av lineær RNA.
Abstract
I tillegg til lineære mRNAs genererer mange eukaryotiske gener sirkulære RNAer. De fleste sirkulære RNAer genereres ved å bli med på et 5’s skjøtested med et oppstrøms 3’s skjøtested i en pre-mRNA, en prosess som kalles tilbakesplening. Denne sirkulæriseringen er sannsynligvis hjulpet av sekundære strukturer i pre-mRNA som bringer skjøteområdene i umiddelbar nærhet. I menneskelige gener antas Alu-elementer å fremme disse sekundære RNA-strukturene, da Alu-elementer er rikelig og viser grunnleggende komplementæriteter med hverandre når de er tilstede i motsatte retninger i pre-mRNA. Her beskriver vi generering og analyse av store Alu-element som inneholder reportergener som danner sirkulære RNAer. Gjennom optimalisering av kloning protokoller, reporter gener med opptil 20 kb insert lengde kan genereres. Deres analyse i co-transfection eksperimenter tillater identifisering av regulatoriske faktorer. Dermed kan denne metoden identifisere RNA-sekvenser og cellulære komponenter som er involvert i sirkulær RNA-dannelse.
Introduction
Sirkulære RNAs
Sirkulære RNAer (circRNAs) er kovalent lukket enkelt strandet RNAs som uttrykkes i de fleste organismer. De genereres ved å bli med i et nedstrøms 5’s skjøtested til et oppstrøms 3’s skjøtested, en prosess som kalles tilbakesplening (Figur 1A)1. Sekvenser i pre-mRNA som viser base komplementære så kort som 30-40 nt bringe tilbake-skjøte steder i riktig justering for circRNA formasjon2. Hos mennesker danner Alu-elementer 1, som representerer ca 11% av genomet3, omfattende dobbeltstrandede RNA-strukturer i pre-mRNA på grunn av deres selvkomplementaritet4,5 og dermed fremmer dannelsen av circRNAs1.
For tiden er tre hovedfunksjoner i circRNAs beskrevet. Noen circRNAs binde microRNAs (miRNAs) og gjennom sekvestrasjon fungere som miRNA svamper6. CircRNAs har vært innblandet i transkripsjonelle og post transkripsjonelle regulering, gjennom konkurranse med lineær spleising7 eller modulering av transkripsjonfaktoraktivitet8. Til slutt inneholder circRNAs korte åpne leserammer og bevis på prinsippstudier viser at de kan oversettes9,10. Funksjonen til de fleste circRNAs forblir imidlertid gåtefull. De fleste sirkulære RNAer er påvist ved hjelp av neste generasjons sekvenseringsmetoder11. Detaljerte analyser av individuelle gener ved hjelp av målrettede RT-PCR-tilnærminger viser at et stort antall sirkulære RNAer gjenstår å bli oppdaget12.
Bruk av reportergener for å analysere pre-mRNA-behandling
Analysen av mRNA avledet fra DNA-reporter konstruerer transfected til celler er en veletablert metode for å studere alternativ pre-mRNA spleising, som kan brukes på sirkulære Rna. Generelt forsterkes og klonet den alternative eksonen, dens omkringliggende introner og konstituerende exons og klonet inn i en eukaryotisk uttrykksvektor. Ofte forkortes intronene. Konstruksjonene er transfected i eukaryyotiske celler og vanligvis analysert av RT-PCR13,14. Denne tilnærmingen har blitt mye brukt til å kartlegge regulatoriske skjøtesteder og trans-fungerende faktorer i co-transfection eksperimenter13,15,16,17,18. I tillegg er genereringen av proteinuttrykkende minigenes tillatt for screening av stoffer som endrer alternativ spleising19,20.
Metoden er brukt på sirkulære RNAer. Foreløpig har minst 12 minigene ryggbein blitt beskrevet i litteraturen og er oppsummert i tabell 1. Med unntak av tRNA-basert uttrykkssystem21,22, er de alle avhengige av polymerase II-arrangører. Her beskriver vi en metode for å generere menneskelige reporterminigenes for å bestemme cis og trans-fungerende faktorer involvert i generering av sirkulære RNAer. En oversikt over metoden ved hjelp av sekvenser av et publisert reportergen23 vises i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generelt er sirkulære RNAer lave rikelig1, noe som kompliserer studiet av deres funksjon og dannelse. I likhet med lineære RNAs13, tillater bruk av reporter minigenes identifisering av cis og trans-fungerende faktorer som regulerer dannelsen av sirkulære RNAer. Dermed genererer denne tilnærmingen hypoteser som kan testes ytterligere ved hjelp av endogene gener.
Det mest kritiske trinnet er utformingen av reportergenet. Den enzymatiske monteri…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Forsvarsdepartementet DoD stipend AZ180075. Stefan Stamm takker Jacqueline Noonan Begavelse. Anna Pawluchin ble støttet av DAAD, tysk akademisk utvekslingsprogram, Justin R. Welden var mottaker av University of Kentucky Max Steckler Award.
Materials
| (PEI) Hydrochloride | Polysciences | 24765-1 | |
| Builder tool | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Dark Reader Transilluminator. | Clare Chemical Research | ||
| Enzymatic DNA assembly kit | NEB | E2621S | |
| Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9282 | |
| Glyco Blue | Thermo Fisher | AM9516 | |
| pcDNA3.1 cloning site | Polycloning site | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
| Polymerase 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA polymerase |
| Polymerase 2 | Biorad | 1725310 | Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad) |
| Polymerase 2 | Qiagen | 206402 | Qiagen long range polymerase kit |
| Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18080044 | |
| RNA isolation kit | Life Technologies | 12183025 | Ambion by Life Technologies |
| RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter/Lucigen |
| Stable competent cells | NEB | C3040H | NEB stable cells |
| Standard cloning bacteria | NEB | C2988J | NEB5-alpha competent |
| Web tool to design primers | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Web-based temperature calculations | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main |
Referências
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).
- Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).
- Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).
- Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435 (2015).
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).
- Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
- Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
- Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).
- Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
- Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).
- Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).
- Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. , 1-7 (2017).
- Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
- Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).
- Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
- Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).
- Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
- Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).
- Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).
- Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).
- Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
- Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).
- Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).
- Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5′-modified long and short RNAs. Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).
- Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).
- Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).
- Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21 (2), 172-179 (2015).
- Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
- Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215 (2016).
- Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolism. 85, 192-204 (2018).
- Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).
- Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
- Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).
- Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).
