Summary

Användning av Alu Element som innehåller Minigenes för att analysera cirkulära RNA

Published: March 10, 2020
doi:

Summary

Vi klonar och analyserar reportergener som genererar cirkulära RNAs. Dessa reporter gener är större än konstruktioner för att analysera linjär splitsning och innehåller Alu element. För att undersöka de cirkulära RNA transfecteds konstruktionerna till celler och resulterande RNA analyseras med RT-PCR efter borttagning av linjärRNA.

Abstract

Förutom linjära mRNAs genererar många eukaryota gener cirkulära RNA. De flesta cirkulära RNAs genereras genom att gå med i en 5 ‘skarv plats med en uppströms 3 ‘ skarv plats inom en pre-mRNA, en process som kallas back-split. Denna cirkulärisering är sannolikt med hjälp av sekundära strukturer i pre-mRNA som föra skarv platser i närheten. I mänskliga gener, Alu element tros främja dessa sekundära RNA strukturer, som Alu element är rikliga och uppvisar bas komplementarities med varandra när de finns i motsatta riktningar i pre-mRNA. Här beskriver vi generering och analys av stora, Alu-element som innehåller reportergener som bildar cirkulära RNAs. Genom optimering av kloningsprotokoll kan reportergener med upp till 20 kb skärlängd genereras. Deras analys i samtransfection experiment gör det möjligt att identifiera regleringsfaktorer. Således kan denna metod identifiera RNA-sekvenser och cellulära komponenter som deltar i cirkulär RNA-bildning.

Introduction

Cirkulära RNAs
Cirkulära RNAs (circRNAs) är kovalent slutna enda strandsatta RNAs som uttrycks i de flesta organismer. De genereras genom att gå med i en nedströms 5’s skarv plats till en uppströms 3 ‘skarv plats, en process som kallas back-split(figur 1A)1. Sekvenser i pre-mRNA som uppvisar bas kompletterande så kort som 30-40 nt föra back-skarv platser i korrekt anpassning för circRNA formation2. Hos människor bildar Alu element1, som representerar cirka 11% av genomet3, omfattande dubbla strandsatta RNA strukturer i pre-mRNA på grund av deras självkomplementaritet4,5 och därmed främja bildandet av circRNAs1.

För närvarande har tre viktiga funktioner circRNAs beskrivits. Vissa circRNAs binder microRNAs (miRNAs) och genom kvarstad agera som miRNA svampar6. CircRNAs har varit inblandad i transkriptions- och posttranskriptionsreglering, genom konkurrens med linjär splitsning7 eller modulering av transkriptionsfaktoraktivitet8. Slutligen innehåller circRNAs korta öppna läsramar och bevis på principstudier visar att de kan översättas9,10. Funktionen hos de flesta circRNAs förblir dock gåtfull. Majoriteten av cirkulära RNA har upptäckts med hjälp av nästa generations sekvenseringsmetoder11. Detaljerade analyser av enskilda gener med hjälp av riktade RT-PCR-metoder visar att ett stort antal cirkulära RNAs återstår att upptäcka12.

Användning av reportergener för att analysera pre-mRNA-bearbetning
Analysen av mRNA som härrör från DNA-reporter konstruerar transfected i celler är en väletablerad metod för att studera alternativa pre-mRNA splitsning, som kan tillämpas på cirkulära RNAs. I allmänhet förstärks och klonas den alternativa exonen, dess omgivande introner och konstituerande exons och klonas till en eukaryota uttrycksvektor. Ofta förkortas intronerna. Konstruktionerna är transfected i eukaryota celler och vanligtvis analyseras av RT-PCR13,14. Detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning för att kartlägga reglerande skarvplatser och transverkande faktorer i samtransfection experiment13,15,16,17,18. Dessutom gjorde genereringen av proteinuttryckande minigener det möjligt att undersöka ämnen som ändrar alternativa skarvningar 19,20.

Metoden har tillämpats på cirkulära RNA. För närvarande har minst 12 minigena ryggrader beskrivits i litteraturen och sammanfattas i tabell 1. Med undantag för det tRNA-baserade uttryckssystemet21,22, är de alla beroende av polymeras II-initiativtagare. Här beskriver vi en metod för att generera mänskliga reporter minigener för att bestämma cis och transverkande faktorer som är involverade i genereringen av cirkulära RNA. En översikt över metoden med hjälp av sekvenser av en publicerad reporter gen23 visas i figur 1.

Protocol

1. Konstruktionernas konstruktioner Använd UCSC genomen webbläsare24 för att identifiera repetitiva element som är nödvändiga för cirkulär RNA-bildning och införliva dem i konstruktionerna. Viktigt, primers för förstärkning måste vara utanför repetitiva element. Klistra in den cirkulära RNA-sekvensen(kompletterande figur 1 är en testsekvens) i https://genome.ucsc.edu/…

Representative Results

Reporter gener tillåter bestämning av reglerande faktorer som påverkar cirkulär RNA-bildning. Dessa reportergener är dock stora och innehåller repetitiva element som ofta gör DNA-konstruktioner instabila. På grund av deras stora storlek är det ofta nödvändigt att ta bort delar av intronerna, vilket uppnås genom att förstärka genomiska bitar som innehåller exons och mindre flankerande introniska delar. Dessa DNA-bitar är enzymatically monterade, vilket möjliggör konstruktion utan begränsning enzymer.</p…

Discussion

I allmänhet cirkulära RNAs är låga rikliga1, vilket komplicerar studiet av deras funktion och bildning. I likhet med linjära RNAs13, användningen av reporter minigenes tillåter identifiering av cis och transverkande faktorer som reglerar bildandet av cirkulära RNA. Således genererar detta tillvägagångssätt hypoteser som kan testas ytterligare med hjälp av endogena gener.

Det mest kritiska steget är utformningen av reportergenen. Den…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av Försvarsdepartementet DoD bidrag AZ180075. Stefan Stamm tackar Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin stöddes av DAAD, tyska akademiska utbytesprogram, Justin R. Welden var mottagare av University of Kentucky Max Steckler Award.

Materials

(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main

Referências

  1. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  2. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  3. Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).
  4. Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).
  5. Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).
  6. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
  7. Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).
  8. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
  9. Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).
  10. Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435 (2015).
  11. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).
  12. Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).
  13. Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
  14. Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
  15. Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
  16. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
  17. Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).
  18. Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
  19. Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).
  20. Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).
  21. Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. , 1-7 (2017).
  22. Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
  23. Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).
  24. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
  25. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  26. Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).
  27. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  29. Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).
  30. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  31. Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).
  32. Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).
  33. Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).
  34. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  35. Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).
  36. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).
  37. Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5′-modified long and short RNAs. Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).
  38. Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).
  39. Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).
  40. Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21 (2), 172-179 (2015).
  41. Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
  42. Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215 (2016).
  43. Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolism. 85, 192-204 (2018).
  44. Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).
  45. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  46. Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).
  47. Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).
check_url/pt/59760?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).

View Video