ट्यूमर प्रगति और एंजियोजेनेसिस की दोहरी Bioluminescence इमेजिंग
Summary
इस प्रोटोकॉल दोहरी bioluminescence इमेजिंग द्वारा वास्तविक समय में ट्यूमर प्रगति और एंजियोजेनेसिस की निगरानी करने के लिए एक ट्यूमर असर माउस मॉडल की स्थापना का वर्णन करता है।
Abstract
एंजियोजेनेसिस, ट्यूमर प्रगति की एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया के रूप में, एक अनुसंधान हॉटस्पॉट और एंटी ट्यूमर थेरेपी का लक्ष्य बन गया है। हालांकि, ट्यूमर प्रगति और एक दृश्य और संवेदनशील तरीके से एक साथ एंजियोजेनेसिस अनुरेखण के लिए कोई विश्वसनीय मॉडल नहीं है। Bioluminescence इमेजिंग उच्च संवेदनशीलता, मजबूत विशिष्टता, और सटीक माप के अपने फायदे के कारण इमेजिंग रहने में अपनी अनूठी श्रेष्ठता प्रदर्शित करता है. यहाँ प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल के लिए एक Renilla luciferase लेबल murine स्तन कैंसर सेल लाइन 4T1 angiogenesis प्रेरित जुगनू luciferase अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक माउस में इंजेक्शन द्वारा एक ट्यूमर असर माउस मॉडल स्थापित करने के लिए है. इस माउस मॉडल एक साथ एक ही माउस में दोहरी bioluminescence इमेजिंग द्वारा वास्तविक समय में ट्यूमर प्रगति और एंजियोजेनेसिस की निगरानी करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है। इस मॉडल को व्यापक रूप से विरोधी ट्यूमर दवा स्क्रीनिंग और ऑन्कोलॉजी अनुसंधान में लागू किया जा सकता है।
Introduction
एंजियोजेनेसिस छोटे से कैंसर की प्रगति में एक आवश्यक प्रक्रिया है, स्थानीयकृत neoplasms बड़ा करने के लिए, संभावित metastatic ट्यूमर1,2. ट्यूमर के विकास और एंजियोजेनेसिस के बीच सहसंबंध ऑन्कोलॉजी अनुसंधान के क्षेत्र में जोर देने के बिंदुओं में से एक बन जाता है। हालांकि, morphologic परिवर्तन को मापने के पारंपरिक तरीकों ट्यूमर प्रगति और एक साथ रहने वाले जानवरों में एक दृश्य दृष्टिकोण का उपयोग कर एंजियोजेनेसिस की निगरानी करने में विफल।
ट्यूमर कोशिकाओं के Bioluminescence इमेजिंग (BLI) अपनी गैर आक्रामकता, संवेदनशीलता, और विशिष्टता3,4,5,6 की वजह से ट्यूमर के विकास की निगरानी करने के लिए एक विशेष रूप से उपयुक्त प्रयोगात्मक विधि है . BLI प्रौद्योगिकी सिद्धांत है कि luciferase एक विशिष्ट सब्सट्रेट के ऑक्सीकरण उत्प्रेरित कर सकते हैं, जबकि bioluminscence उत्सर्जन पर आधारित है. प्रत्यारोपित ट्यूमर कोशिकाओं में व्यक्त luciferase इंजेक्शन सब्सट्रेट के साथ प्रतिक्रिया करता है, जो एक जीवित इमेजिंग प्रणाली द्वारा पता लगाया जा सकता है, और संकेत परोक्ष रूप से विवो6,7में सेल संख्या या सेल स्थानीयकरण में परिवर्तन को प्रतिबिंबित .
ट्यूमर के विकास के अलावा, ट्यूमर एंजियोजेनेसिस (कैंसर प्रगति में महत्वपूर्ण कदम) भी Vegfr2-Fluc-KI ट्रांसजेनिक चूहों8,9,10का उपयोग कर BLI प्रौद्योगिकी के माध्यम से कल्पना की जा सकती है। संवहनी endothelial विकास कारक (Vegf) रिसेप्टर 2 (Vegfr2), Vegf रिसेप्टर का एक प्रकार, ज्यादातर वयस्क चूहों11की संवहनी endothelial कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है. Vegfr2-Fluc-KI ट्रांसजेनिक चूहों में, जुगनू ल्यूसिफरेस (Fluc) के डीएनए अनुक्रम अंतर्जात Vegfr2 अनुक्रम के पहले exon में खटखटाया है. नतीजतन, फ्लूक व्यक्त किया जाता है (जो BLI संकेतों के रूप में प्रकट होता है) एक तरीके से है कि चूहों में एंजियोजेनेसिस के स्तर के समान है. आकार में कुछ मिलीमीटर से परे विकसित करने के लिए, ट्यूमर मौजूदा रक्त वाहिकाओं से नए vascualures भर्ती, जो अत्यधिक Vegfr2 ट्यूमर कोशिकाओं से विकास कारकों से ट्रिगर व्यक्त1. यह बीएलआई द्वारा गैर-आक्रामक रूप से ट्यूमर एंजियोजेनेसिस की निगरानी करने के लिए Vegfr2-Fluc-KI ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने की संभावना को खोलता है।
इस प्रोटोकॉल में, एक ट्यूमर असर माउस मॉडल जुगनू luciferase (Fluc) और Renilla luciferase (Rluc) इमेजिंग, क्रमशः (चित्र 1) के माध्यम से एक ही माउस में ट्यूमर प्रगति और एंजियोजेनेसिस की निगरानी करने के लिए स्थापित किया गया है। एक 4T1 सेल लाइन (4T1-आरआर) बनाया गया है कि stably Rluc और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP) Rluc इमेजिंग द्वारा सेल विकास का पता लगाने के लिए व्यक्त करता है. आगे ट्यूमर की प्रगति और प्रतिगमन में एंजियोजेनेसिस के गतिशील परिवर्तन की जांच करने के लिए, एक और 4T1 सेल लाइन (4T1-RRT) आत्महत्या जीन दाद सिंप्लेक्स वायरस छोटा थाइमिडीन kinase (HSV-ttk), Rluc, और आरएफपी व्यक्त करता है बनाया गया है। ganciclovir (GCV) के प्रशासन द्वारा, एचएसवी-टीके व्यक्त कोशिकाओं चुनिंदा ablated हैं. इन सेल लाइनों के आधार पर, Vegfr2-Fluc-KI चूहों में एक ट्यूमर असर मॉडल बनाया गया है कि एक प्रयोगात्मक मॉडल ट्यूमर प्रगति और विवो में ट्यूमर एंजियोजेनेसिस ब्रिजिंग के रूप में कार्य करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, एक गैर इनवेसिव दोहरी BLI दृष्टिकोण ट्यूमर के विकास और एंजियोजेनेसिस की निगरानी के लिए वर्णित है. BLI रिपोर्टर प्रणाली पहले विकसित की है, Rluc इमेजिंग द्वारा विवो में ट्यूमर प्रगति और प्रतिग?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2017YFA0103200), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81671734), और तियानजिन विज्ञान और प्रौद्योगिकी सहायता कार्यक्रम की प्रमुख परियोजनाओं (18YF]CSY00010), मौलिक अनुसंधान कोष के लिए द्वारा समर्थित किया गया था केन्द्रीय विश्वविद्यालय (63191155)। हम ग्लोरिया Nance संशोधन है, जो हमारी पांडुलिपि की गुणवत्ता में सुधार लाने में मूल्यवान थे स्वीकार करते हैं.
Materials
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
Referências
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