腫瘍進行と血管新生の二重生物発光イメージング
Summary
このプロトコルは、二重生物発光イメージングによって腫瘍の進行および血管新生をリアルタイムで監視する腫瘍担持マウスモデルの確立について説明する。
Abstract
血管新生は、腫瘍進行の重要なプロセスとして、抗腫瘍療法の研究ホットスポットおよび標的となっている。しかし、腫瘍の進行と血管新生を視覚的かつ敏感な方法で同時に追跡するための信頼性の高いモデルはありません。生物発光イメージングは、高感度、強い特異性、正確な測定の利点により、生きたイメージングにおける独自の優位性を発用します。ここで提示されるのは、血管新生誘発ホタルルシフェラーゼ発現を有するトランスジェニックマウスにレニラ・ルシフェラーゼ標識マウス乳癌細胞株4T1を注入することによって腫瘍性マウスモデルを確立するためのプロトコルである。このマウスモデルは、単一のマウスにおける二重生物発光イメージングにより、腫瘍の進行と血管新生をリアルタイムで同時に監視する貴重なツールを提供します。このモデルは、抗腫瘍薬物スクリーニングおよび腫瘍学研究に広く適用されうる。
Introduction
血管新生は、小さな局所的な新生物からより大きな、潜在的に転移性腫瘍1、2への癌の進行に不可欠なプロセスである。腫瘍の増殖と血管新生との相関関係は、腫瘍学研究の分野で重点の一つとなる。しかし、形態学的変化を測定する従来の方法は、視覚化されたアプローチを使用して、生きた動物の腫瘍の進行と血管新生を同時に監視することができません。
腫瘍細胞の生物発光イメージング(BLI)は、その非侵襲性、感受性、および特異性3、4、5、6のために腫瘍の増殖を監視するための特に適切な実験方法である.BLI技術は、ルシフェラーゼが生物発光を放出しながら特定の基質の酸化を触媒することができるという原理に基づいています。移植された腫瘍細胞で発現されるルシフェラーゼは、生体イメージングシステムによって検出することができる注入された基板と反応し、シグナルは生体内6、7における細胞数または細胞局在化の変化を間接的に反映する。
腫瘍増殖を除いて、腫瘍血管新生(癌進行の重要なステップ)はまた、Vegfr2-Fluc-KIトランスジェニックマウス8、9、10を用いてBLI技術を用いて可視化することができる。血管内皮増殖因子(Vegf)受容体2(Vegfr2)は、Vegf受容体の1つのタイプであり、主に成体マウス11の血管内皮細胞において発現される。Vegfr2-Fluc-KIトランスジェニックマウスでは、ホタルルシフェラーゼ(Fluc)のDNA配列が内因性Vegfr2配列の最初のエキソンにノックされる。その結果、Flucは、マウスの血管新生のレベルと同じ方法で(BLIシグナルとして現れる)発現する。数ミリメートルを超えて成長するために、腫瘍は、腫瘍細胞1からの成長因子によって引き起こされるVegfr2を高度に発現する既存の血管から新しい血管を新たに産生する。これにより、BlIによる腫瘍血管新生を非侵襲的に監視するためにVegfr2-Fluc-KIトランスジェニックマウスを使用する可能性が開かれる。
このプロトコルでは、ホタルルシフェラーゼ(Fluc)およびレニラ・ルシフェラーゼ(Rluc)イメージングを介して単一のマウスにおける腫瘍進行および血管新生をそれぞれモニタリングする腫瘍性マウスモデルが確立される(図1)。4T1細胞株(4T1-RR)を作成し、Rlucイメージングにより細胞増殖を追跡するためにRlucおよび赤色蛍光タンパク質(RFP)を安定的に発現させる。腫瘍の進行および回帰における血管新生の動的変化をさらに調べるため、自殺遺伝子ヘルペス単純ヘルペスを発現する別の4T1細胞株(4T1-RRT)が作成され、チミジンキナーゼ(HSV-ttk)、Rluc、およびRFPが切り捨てられた。ガンシクロビル(GCV)の投与により、HSV-ttk発現細胞は選択的にアブレーションされる。これらの細胞株に基づいて、Vegfr2-Fluc-KIマウスにおける腫瘍担持モデルは、生体内で腫瘍進行および腫瘍血管新生を橋渡しする実験モデルとして機能する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、腫瘍の発達および血管新生をモニタリングするための非侵襲的二重BLIアプローチについて説明する。BLIレポーターシステムは、Rlucイメージングによって生体内の腫瘍進行および回帰を追跡するためのHSV-ttk/GCV自殺遺伝子を含む最初に開発されました。一方、腫瘍血管新生は、Flucイメージングを介してVegfr2-Fluc-KIマウスを用いて評価される。この腫瘍を持つマウスモデル?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、中国国家主要研究開発プログラム(2017YFA0103200)、中国国家自然科学財団(81671734)、天津科学技術支援プログラム(18YFZCSY00010)の主要プロジェクト(18YFZCSY00010)の基礎研究資金によって支援されました。中央大学(63191155)。我々は、原稿の品質向上に貴重であったグロリア・ナンスの改訂を認めます。
Materials
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
Referências
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