Двойное биолюминесценционное изображение прогрессирования опухоли и ангиогенеза
Summary
Этот протокол описывает создание опухолевой мыши модели для мониторинга прогрессирования опухоли и ангиогенеза в режиме реального времени двойной биолюминесценции изображений.
Abstract
Ангиогенез, как решающий процесс прогрессирования опухоли, стал горячей точкой исследования и мишенью противоопухолевой терапии. Однако, нет надежной модели для отслеживания прогрессирования опухоли и ангиогенеза одновременно в визуальной и чувствительной манере. Биолюминесценция изображения отображает свое уникальное превосходство в живой визуализации из-за его преимущества высокой чувствительности, сильная специфичность, и точные измерения. Представлено здесь протокол для создания опухолевых мыши модели путем введения Renilla luciferase помечены морин рака молочной железы линии 4T1 в трансгенной мыши с ангиогенезом индуцированной светлячок выражение. Эта модель мыши обеспечивает ценный инструмент для одновременного мониторинга прогрессирования опухоли и ангиогенеза в режиме реального времени путем двойной биолюминесценции изображения в одной мыши. Эта модель может быть широко применена в скрининге противоопухолевого препарата и онкологических исследованиях.
Introduction
Ангиогенез является важным процессом в прогрессировании рака от небольших, локализованных неоплазм ы на большие, потенциально метастатические опухоли1,2. Корреляция между ростом опухоли и ангиогенезом становится одной из точек внимания в области онкологических исследований. Однако традиционные методы измерения морфологических изменений не контролируют прогрессирование опухоли и ангиогенез одновременно у живых животных с помощью визуализированного подхода.
Биолюминесценция (BLI) опухолевых клеток является особенно подходящим экспериментальным методом для мониторинга роста опухоли из-за его неинвазивности, чувствительности и специфичности3,4,5,6 . Технология BLI основана на принципе, что люцифераза может катализировать окисление конкретного субстрата при испускании биолюминесценции. Люцифераза, выраженная в имплантированных опухолевых клетках, реагирует с инъекционным субстратом, который может быть обнаружен живой системой визуализации, и сигналы косвенно отражают изменения в количестве клеток или локализации клеток in vivo6,7.
За исключением роста опухоли, опухолевый ангиогенез (критический шаг в прогрессии рака) также может быть визуализирована с помощью технологии BLI с использованием Vegfr2-Fluc-KI трансгенных мышей8,9,10. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (Vegf) рецептор 2 (Vegfr2), один тип рецептора Vegf, в основном выражается в сосудистых эндотелиальных клетках взрослых мышей11. В Vegfr2-Fluc-KI трансгенных мышей, последовательность ДНК светлячок (Fluc) постучал в первый экзон эндогенной последовательности Vegfr2. В результате, Fluc выражается (который появляется как сигналы BLI) таким образом, что идентична уровню ангиогенеза у мышей. Чтобы вырасти за несколько миллиметров в размерах, опухоль набирает новые сосуды из существующих кровеносных сосудов, которые высоко выражают Vegfr2 вызвано факторами роста из опухолевых клеток1. Это открывает возможность использования Vegfr2-Fluc-KI трансгенных мышей неинвазивно контролировать ангиогенез опухоли BLI.
В этом протоколе, опухолевые мыши модель установлена для мониторинга прогрессирования опухоли и ангиогенеза в одной мыши через Светлячок люциферазы (Fluc) и Ренилья luciferase (Rluc) изображений, соответственно (Рисунок 1). 4T1 клеточной линии (4T1-RR) создается, что стационарно выражает Rluc и красный флуоресцентный белок (RFP) для отслеживания роста клеток Rluc изображений. Для дальнейшего изучения динамических изменений ангиогенеза в прогрессии и регрессии опухоли, другой 4T1 клеточной линии (4T1-RRT) создается, что выражает самоубийство гена простого герпеса вирус усеченный тимидин киназы (HSV-ttk), Rluc, и RFP. При администрации ганцикловира (GCV), HSV-ttk выражающие клетки избирательно абляции. На основе этих клеточных линий построена модель опухолевых мышей Vegfr2-Fluc-KI, которая служит экспериментальной моделью, преодолевая прогрессирование опухоли и опухолевой ангиогенез in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе описан неинвазивный двойной blI подход для мониторинга развития опухоли и ангиогенеза. Система репортеров BLI впервые разработана, содержащая ген самоубийцы HSV-ttk/GCV для отслеживания прогрессирования опухоли и регрессии in vivo с помощью rluc imaging. Между тем, опухолевый ангиоге…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальной программой исследований и разработок Китая (2017YFA0103200), Национальным фондом естественных наук Китая (81671734) и ключевыми проектами программы научно-технической поддержки Тяньцзиня (18YF-CSY00010), Фондам фундаментальных исследований для Центральные университеты (63191155). Мы признаем изменения Глории Нэнс, которые были полезны для улучшения качества нашей рукописи.
Materials
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
Referências
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).
- Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC. Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).
- Wang, R., et al. Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence. Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).
- Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. Tumor angiogenesis, from foe to friend. Science. 349, 694-695 (2015).
- Zhang, K., et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment. ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. , 70-81 (2017).
- Lee, S., et al. Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis. Cell. 130, 691-703 (2007).
- Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response. Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).
- Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).
- Wong, P. P., et al. Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread. Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).
- Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).
- Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy. Biochimie. 116, 43-51 (2015).
- Liu, J., et al. Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).
- Branchini, B. R., et al. Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments. Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).
- McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing "red-shifted" luciferase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).
