Imagem de bioluminescência dupla de progressão tumoral e angiogênese
Summary
Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo do rato do tumor-rolamento para monitorar a progressão e a angiogênese do tumor no tempo real pela imagem latente dupla do bioluminescência.
Abstract
A angiogênese, como um processo crucial de progressão tumoral, tornou-se um ponto de pesquisa e alvo de terapia antitumoral. Entretanto, não há nenhum modelo de confiança para traçar a progressão e a angiogênese do tumor simultaneamente em uma maneira visual e sensível. A imagem latente de bioluminescence indica sua superioridade original na imagem latente viva devido a suas vantagens da sensibilidade elevada, da especificidade forte, e da medida exata. É apresentado aqui um protocolo para estabelecer um modelo do rato do tumor-rolamento injetando um renilla luciferase-etiquetou a linha de pilha do cancro da mama murino 4T1 no rato transgênicas com expressão angiogénese-induzida do luciferase do Firefly. Este modelo do rato fornece uma ferramenta valiosa para monitorar simultaneamente a progressão e a angiogênese do tumor no tempo real pela imagem latente dupla do bioluminescência em um único rato. Este modelo pode ser amplamente aplicado na triagem de drogas antitumorais e na pesquisa oncológica.
Introduction
A angiogênese é um processo essencial na progressão do câncer de neoplasias pequenas e localizadas para tumores maiores e potencialmente metastáticos1,2. A correlação entre o crescimento tumoral e a angiogênese torna-se um dos pontos de ênfase no campo da pesquisa oncológica. Entretanto, os métodos tradicionais de medir mudanças morfológicas não conseguem monitorar a progressão e a angiogênese do tumor simultaneamente em animais vivos usando uma aproximação visualizada.
A imagem de bioluminescência (bli) de células tumorais é um método experimental particularmente apropriado para monitorar o crescimento tumoral por causa de sua não-invasividade, sensibilidade e especificidade3,4,5,6 . A tecnologia de BLI é baseada no princípio que o luciferase pode catalisar a oxidação de um substrato específico ao emitir o bioluminescence. A luciferase expressa em células tumorais implantadas reage com o substrato injetado, que pode ser detectado por um sistema de imagem vivo, e os sinais refletem indiretamente as alterações no número de células ou na localização da célula in vivo6,7.
Com exceção do crescimento tumoral, a angiogênese tumoral (o passo crítico na progressão do câncer) também pode ser visualizada através da tecnologia bli usando camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-Ki8,9,10. O receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) 2 (Vegfr2), um tipo de receptor de VEGF, é expressado na maior parte nas pilhas endothelial vasculares de ratos adultos11. Em camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-KI, a seqüência de DNA de Firefly luciferase (Fluc) é derrubado no primeiro exon da seqüência Vegfr2 endógena. Como resultado, o Fluc é expresso (que aparece como sinais de BLI) de uma forma que é idêntica ao nível de angiogênese em camundongos. Para crescer além de alguns milímetros de tamanho, o tumor recruta novas vasculaturas de vasos sanguíneos existentes, que expressam altamente o Vegfr2 desencadeado por fatores de crescimento das células tumorais1. Isso abre a possibilidade de usar camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-KI para monitorar não invasivamente a angiogênese tumoral por BLI.
Neste protocolo, um modelo do rato do tumor-rolamento é estabelecido para monitorar a progressão e a angiogênese do tumor em um único rato através da imagem latente do luciferase de Firefly (Fluc) e do luciferase de Renilla (Rluc), respectivamente (Figura 1). Uma linha de pilha 4T1 (4T1-RR) é criada que expressa estàvel Rluc e a proteína fluorescente vermelha (RFP) para traçar o crescimento da pilha por imagem latente de Rluc. Para investigar mais as mudanças dinâmicas da angiogênese na progressão e na regressão do tumor, uma outra linha celular 4T1 (4T1-RRT) é criada que expressa o vírus de herpes simplex do gene do suicídio truncado timidina kinase (HSV-TTK), rluc, e RFP. Pela administração de ganciclovir (GCV), as células de expressão de HSV-TTK são seletivamente abladas. Baseado nestas linhas de pilha, um modelo do tumor-rolamento em ratos de Vegfr2-Fluc-KI é construído que sere como um modelo experimental que ponte a progressão do tumor e a angiogênese do tumor in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, uma aproximação dupla não invasora de BLI é descrita para monitorar o desenvolvimento e a angiogênese do tumor. O sistema do repórter de BLI é desenvolvido primeiramente, contendo o gene do suicídio de HSV-TTK/GCV para seguir a progressão do tumor e a regressão in vivo pela imagem latente de Rluc. Enquanto isso, a angiogênese tumoral é avaliada usando camundongos Vegfr2-Fluc-KI via imagem Fluc. Este modelo do rato do tumor-rolamento é capaz de fornecer uma plataforma prática para o desenvol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de chave nacional R & D da China (2017YFA0103200), Fundação Nacional de ciência natural da China (81671734), e projetos-chave do programa de apoio à ciência e tecnologia de Tianjin (18YFZCSY00010), fundos de pesquisa fundamentais para Universidades centrais (63191155). Reconhecemos as revisões da Gloria Nance, que foram valiosas para melhorar a qualidade do nosso manuscrito.
Materials
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
Referências
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