형광 매크로법을 사용하여 그대로 마우스 두개골을 통해 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징
Summary
경두개 광학 화상 진찰은 온전한 두개골을 통해 살아있는 마우스의 피질에 있는 뇌척수액 수송의 광시야 화상 진찰을 허용합니다.
Abstract
설치류의 뇌척수액(CSF) 흐름은 주로 트레이서의 생체 내 정량화를 사용하여 연구되었습니다. 2 광자 현미경 검사법 및 자기 공명 화상 진찰과 같은 기술은 CSF 교류의 생체 내 정량화에서 가능하게 했습니다 그러나 감소된 화상 진찰 부피 및 낮은 공간 해상도에 의해 각각 제한됩니다. 최근 연구는 CSF가 설치류 피질의 pial 및 관통 동맥을 둘러싼 관통 공간의 네트워크를 통해 뇌 의 자렌치마를 입력 하는 것으로 나타났습니다. CSF의 이러한 관능적 진입은 림프계의 주요 동인이며, 독성 대사 용질(예를 들어, 아밀로이드 β)의 통관에 연루된 통로이다. 여기에서, 우리는 살아있는 마우스의 본래 두개골을 통해 형광 CSF 추적자의 실시간, mesoscopic 화상 진찰을 허용하는 새로운 거시적인 화상 진찰 기술을 설명합니다. 이 최소 침습 적 방법은 다양한 실험 설계를 용이하게하고 CSF 역학의 단일 또는 반복 테스트를 가능하게합니다. 대용량 자리는 높은 공간 및 시간 해상도를 가지고 있으며, 그들의 큰 갠트리 및 작업 거리는 행동 장치에서 작업을 수행하는 동안 이미징을 허용합니다. 이 화상 진찰 접근은 이 기술에서 얻은 2 광자 화상 진찰 및 형광 측정을 사용하여 전 생체 외 형광 및 무선 표지한 추적자의 정량화와 강하게 상관관계가 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 경두개 거시적인 화상 진찰이 살아있는 마우스에 있는 림프수송을 평가하기 위하여 이용될 수 있는 방법을 기술합니다, 더 비싼 화상 진찰 양식에 접근가능한 대안을 제안하.
Introduction
뇌척수액 (CSF)은 뇌와 척수를 목욕시키고 항상성을 유지하고 영양분을 공급하며 두개내 압력을 조절하는 데 관여합니다1. 지주막 공간에서 CSF는 피질 피질 동맥을 둘러싼 관통 공간 (PVS)의 네트워크를 통해 뇌로 들어간 다음 관통 하는 동맥을 따라 아래로 흐른다2. 일단 자중에서, CSF는 간질 액체 (ISF)와 교환하고, 낮은 저항성 백색 물질 관 및 perivenous 공간을 통해 뇌에서 아밀로이드 β (Aβ)및 타우 단백질 응집체와 같은 유해한 대사 산물을 운반2,3 . 이 통로는 astroglial aquaporin-4 (AQP4) 채널에 의존하고 따라서 신경교 림프 (glymphatic)시스템 4라고 불려왔다. 신경필의 노폐물은 궁극적으로 CSF-ISF로부터 두개골 신경 근처의 림프관과 자궁 경부 림프절쪽으로 수막에서 5. 이 시스템의 실패는 알츠하이머병 6,7,외상성 뇌 손상 3, 허혈성및 출혈성 뇌졸중 8과 같은여러 신경질환에 연루되어 있다.
CSF 수송은 과거에 시스터나 마그나 (CM)9,10 및 림프관 연구에 트레이서를 주입하여 가시화 할 수 있으며, 주로 2 광자 현미경4,11,12, 13,자기 공명 영상 (MRI)14,15,16,17,및 생체 내 이미징3,6,11, 도 18을 통해 트레이서 역학을 평가한다. 2 광자 현미경 검사법은 그것의 높은 공간 해결책 때문에 PVS및 실치에 있는 CSF 추적자의 상세한 화상 진찰을 위한 적당한 방법입니다, 그러나, 보기의 좁은 필드를 가지고 있고 침략적인 두개골 창 또는 두개골의 숱이 필요합니다. Ex vivo 화상 진찰은, 면역 성 화학과 조합하여, 전체 두뇌19에단 하나 세포에서 구역 수색하는 다단계 분석을 가능하게 합니다. 그러나, 사후 모템 조직을 관찰하는 데 필요한 관류-고정 과정은 CSF 흐름 방향에 중대한 변화를 일으키고 PVS를 붕괴시키고, 트레이서(12)의 분포 및 위치를 현저하게 변화시다. 마지막으로 MRI는 전체 뮤린과 인간의 뇌에 걸쳐 CSF 흐름을 추적 할 수 있지만, 그것은 공간 및 시간 적 흐름의 부족.
새로운 기술, 경두개 거시적 이미징은 살아있는 마우스의 전체 등지 피질에서 경막 CSF 수송의 광시야 이미징을 가능하게함으로써 이러한 제한 사항 중 일부를 해결합니다. 이러한 유형의 이미징은 멀티밴드 필터 큐브, 튜닝 가능한 LED 광원 및 고효율 CMOS 카메라10을사용하는 에피플루서성 대식경으로 수행된다. 이 설정은 두개골 표면 아래 1-2mm까지 PVS를 해결할 수 있으며 두개골을 완전히 그대로 유지하면서 피질 표면 아래 5-6mm까지 형광을 감지 할 수 있습니다10. 여기 파장을 빠르게 조정할 수 있는 멀티밴드 필터와 LED를 사용하면 여러 형광단을 사용할 수 있으므로 CSF는 동일한 실험에서 다양한 분자량 및 화학적 특성의 트레이서로 라벨을 부착할 수 있습니다.
이 절차는 두개골을 노출하고 화상 진찰 세션 도중 머리를 안정시키기 위하여 가벼운 무게 헤드 격판을 두기 위하여 간단하고, 최소침습 수술이 필요합니다. 트레이서는 두개골에 드릴링하거나 피펫 또는 캐뉼러9,20으로피질 조직을 관통하지 않고 CM으로 전달 될 수 있습니다. CM 캐뉼라와 헤드 플레이트는 며칠에서 몇 주까지 안정적으로 유지되며 클래식 엔드포인트 시각화에 비해 보다 복잡한 실험 설계를 용이하게 합니다. 이 프로토콜은 경두개 거시적 이미징이 마취/수면 또는 깨어있는 마우스의 CM에 형광 CSF 추적자의 급성 또는 만성 주입 다음 림프계 기능을 연구하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 상업적으로 이용 가능한 형광 대식검 및 추적자를 사용하여 살아있는 마우스에 있는 경두개 CSF 화상 진찰을 능력을 발휘하기 위한 상세한 프로토콜을 기술했습니다. 이 기술은 간단하고 최소 침습적이지만 정량적입니다. 생체 내 이미징은 CM 전달 후 3H-dextran 및 14C-inulin을 포함한 무선 표지 추적자의 액체 섬광 계수 계수와 전 생체 코로나 섹션 정량화10과…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소와 노화에 국립 연구소에 의해 투자 되었다 (건강의 미국 국립 연구소; R01NS100366 및 RF1AG057575- MN, 우수 프로그램의 Fondation Leducq 대서양 횡단 네트워크, 그리고 EU 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램 (부여 번호 666881; SVDs@대상). 또한 그래픽 일러스트레이션에 대한 전문적인 도움을 주신 Dan Xue에게 도왔습니다.
Materials
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane – Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 – Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
Referências
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