Transcranial optisk avbildning tillåter wide-fält avbildning av cerebrospinalvätska transport i cortex av levande möss genom en intakt skalle.
Cerebrospinalvätska (CSF) flöde i gnagare har till stor del studerats med hjälp av ex vivo kvantifiering av spårämnen. Tekniker som två-Photon mikroskopi och magnetisk resonanstomografi (MRI) har möjliggjort in vivo kvantifiering av CSF flöde men de är begränsade av minskad avbildning volymer och låg rumslig upplösning, respektive. Nyligen arbete har funnit att CSF kommer in i hjärnan parenkymet genom ett nätverk av perivaskulära utrymmen som omger Arvika och penetrerande artärer i gnagare cortex. Detta perivaskulära inträde av CSF är en primär förare av glymphatic systemet, en väg inblandad i clearance av giftiga metaboliska lösta ämnen (t. ex., amyloid-β). Här illustrerar vi en ny makroskopiska Imaging teknik som möjliggör realtid, Mesoskopisk avbildning av fluorescerande CSF spår genom intakt skalle av levande möss. Denna minimalinvasiva metod underlättar en mängd experimentella konstruktioner och möjliggör enkel eller upprepad testning av CSF dynamik. Macroscopes har hög rumslig och temporal beslutsamhet och deras stor portal och arbetande distans tillåta för tänkbar fördriva tiden utför uppgiften på beteende anordningen. Denna avbildning metod har validerats med hjälp av två-Photon Imaging och fluorescens mätningar som erhållits från denna teknik starkt korrelerar med ex vivo fluorescens och kvantifiering av radio-märkta spårämnen. I detta protokoll beskriver vi hur transkraniell makroskopisk avbildning kan användas för att utvärdera glymphatic transport i levande möss, och erbjuder ett tillgängligt alternativ till mer kostsamma avbildningsmetoder.
Cerebrospinalvätska (CSF) badar hjärnan och ryggmärgen och är involverad i att upprätthålla homeostas, leverera näringsämnen, och reglera intrakraniellt tryck1. CSF i subaraknoidalrummet går in i hjärnan genom ett nätverk av perivaskulära utrymmen (PVS) omgivande kortikala Arvika artärer och sedan flyter ner längs penetrerande arterioler2. En gång i parenkymet, CSF utbyten med interstitiell vätska (ISF), transporterar skadliga metaboliter såsom amyloid-β (Aβ) och tau protein aggregat ut ur hjärnan genom låg motståndskraft vit materia skrifter och perivenösa utrymmen2,3 . Denna väg är beroende av astroglial aquaporin-4 (AQP4) kanaler och har därför kallats den Glial-lymfatiska (glymphatic) system4. Avfallsprodukter av neuropil slutligen rensas från CSF-ISF genom lymfkärl nära kranialnerver och i hjärnhinnorna ut mot livmoderhalsen lymfkörtlar5. Misslyckandet med detta system har varit inblandad i flera neurologiska sjukdomar som Alzheimers sjukdom6,7, traumatisk hjärnskada3, och ischemisk och hemorragisk stroke8.
CSF transport kan visualiseras genom infusion spårämnen i Cisterna magna (cm)9,10 och glymphatic studier i det förflutna har främst utnyttjat två-Photon mikroskopi4,11,12, 13, magnetisk resonanstomografi (MRI)14,15,16,17och ex vivo Imaging3,6,11, 18 för att utvärdera spårkinetik. Två-Photon mikroskopi är en lämplig metod för detaljerad avbildning av CSF spårämnen i PVSs och parenkymet på grund av dess höga rumsliga upplösning, men det har ett smalt synfält och kräver en invasiv kranial fönster eller gallring av skallen. Ex vivo Imaging, i kombination med immunohistokemi, möjliggör multinivåanalyser som sträcker sig från enstaka celler upp till hela hjärnan19. Emellertid, processen för perfusion-fixering som krävs för att iaktta post-mortem vävnad producerar djupgående förändringar i CSF flödesriktning och kollapsar PVS, avsevärt ändra fördelningen och placeringen av spårämnen12. Slutligen, medan MRI kan spåra CSF flöde genom hela murin och mänskliga hjärnan, det saknar rumsliga och temporal upplösning av perivaskulära flödet.
En ny teknik, transkraniell makroskopisk avbildning, löser några av dessa begränsningar genom att möjliggöra bred fält avbildning av perivaskulär CSF transport i hela dorsala cortex av levande möss. Denna typ av avbildning görs med ett epifluorescerande makroskop med hjälp av en flerbandsfilterkub, en avstämbar LED-ljuskälla och högeffektiv CMOS-kamera10. Dessa uppställningar har möjlighet att lösa PVSs upp till 1-2 mm under skallytan och kan detektera fluoroforer upp till 5-6 mm under den kortikala ytan och lämnar skallen helt intakt10. Flerbandsfilter och lysdioder som snabbt kan finjustera magnetiseringsvåglängden möjliggör användning av flera fluoroforer som tillåter CSF att märkas med spår av olika molekylvikter och kemiska egenskaper i samma experiment.
Detta förfarande kräver en enkel, minimalt invasiv kirurgi för att exponera skallen och placera en lätt huvud plattan att stabilisera huvudet under fotografering sessionen. Tracers kan levereras in i cm utan att borra i skallen eller tränga in i kortikal vävnad med pipetter eller kanyl9,20. Båda CM kanylerna och huvud plattorna förblir stabila i flera dagar till veckor och underlättar mer komplexa experimentella konstruktioner jämfört med den klassiska slutpunkts visualiseringen. Detta protokoll beskriver hur transkrakala makroskopiska avbildning används för att studera glymphatic system funktion efter akut eller kronisk injektion av fluorescerande CSF Tracer i CM av anestetized/sova eller vakna möss.
Vi har beskrivit ett detaljerat protokoll för att utföra transkraniell CSF avbildning hos levande möss med hjälp av kommersiellt tillgängliga fluorescerande makroskop och tracers. Denna teknik är enkel och minimalt invasiva, men ändå kvantitativ. In vivo-avbildning korrelerar väl med känsliga metoder såsom vätske scintillationskontroller av radiostyrda spårämnen inklusive 3H-dextran och 14C-inulin efter cm leverans, samt med kvantifiering för ex vivo-sektion10<…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke och det nationella institutet för åldrande (US National Institutes of Health; R01NS100366 och RF1AG057575 till MN), Fondation Leducq transatlantiska nätverk för excellensprogram och EU: s Horisont 2020 forsknings-och innovationsprogram (Grant nr 666881; SVDs @ Target). Vi vill också tacka Dan Xue för experthjälp med grafiska illustrationer.
0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
Isoflurane – Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
PE10 – Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
Xylazine | University of Rochester Vivarium |