Caractériser les mutants liés à la maladie des kinases familiales de la RAF en utilisant un ensemble de méthodes pratiques et réalisables
Summary
Dans cet article, nous avons présenté un ensemble de méthodes pratiques et réalisables pour caractériser les mutants liés à la maladie des kinases de la famille raf, qui comprennent l’analyse in vitro de kinase, l’analyse de co-activation de RAF, et l’analyse de luciferase fractionnée complémentaire.
Abstract
Les kinases de la famille du fibrosarcome accéléré (RAF) jouent un rôle central dans la biologie cellulaire et leur dysfonctionnement conduit à des cancers et des troubles du développement. Une caractérisation des mutants de la RAF liés à la maladie nous aidera à choisir des stratégies thérapeutiques appropriées pour le traitement de ces maladies. Des études récentes ont montré que les kinases de la famille RAF ont à la fois des activités catalytiques et allostériques, qui sont étroitement réglementées par la dimerisation. Ici, nous avons construit un ensemble de méthodes pratiques et réalisables pour déterminer les activités catalytiques et allostériques et l’affinité relative dimer / stabilité des kinases de la famille RAF et de leurs mutants. Tout d’abord, nous avons modifié l’assay kinase in vitro classique en réduisant la concentration de détergent dans les tampons, en utilisant une procédure de lavage rapide doux, et en employant un glutathion S-transferase (GST) fusion pour empêcher les dissécages RAF de se dissocier pendant purification. Cela nous permet de mesurer l’activité catalytique des mutants de la RAF constitutivement actifs de manière appropriée. Deuxièmement, nous avons mis au point un nouvel essai de co-activation de la RAF pour évaluer l’activité allostérique des mutants de la RAF morts par la kinase en utilisant des protéines de la RAF tronquées n-terminales, éliminant ainsi l’exigence de Ras actif dans les protocoles actuels et réalisant ainsi une sensibilité. Enfin, nous avons généré un essai unique de luciferase fractionnée complémentaire pour mesurer quantitativement l’affinité relative dimère/stabilité de divers mutants de RAF, qui est plus fiable et sensible comparée à l’essai traditionnel de co-immunoprécipitation. En résumé, ces méthodes présentent les avantages suivants : (1) conviviale; (2) capable d’effectuer efficacement sans équipement de pointe; (3) rentable; (4) très sensible et reproductible.
Introduction
Les kinases de la famille RAF sont un composant clé de la cascade de signalisation RAS/RAF/MEK/ERK, qui transmet un signal de RAS pour activer la kinase protéine activée par mitogène (MEK)1,2,3,4. Cette famille de kinases joue un rôle crucial dans la croissance cellulaire, la survie et la différenciation, et leurs altérations induisent de nombreuses maladies, notamment le cancer5,6,7,8. Récemment, les séquençages génomiques ont identifié de nombreux mutants de la RAF liés à la maladie qui présentent des propriétés différentes dans la transmission du signal de la cascade RAS/RAF/MEK/ERK9,10,11. Une caractérisation minutieuse des mutants de la RAF nous aidera à comprendre les mécanismes moléculaires de la façon dont les mutants de la RAF modifient la production de signaux de la cascade RAS/RAF/MEK/ERK, et éventuellement choisir des approches appropriées pour traiter diverses maladies mutantes de la RAF.
Les kinases de la famille RAF comprennent trois membres, CRAF, BRAF, et ARAF, qui ont des structures moléculaires similaires, mais différentes capacités pour activer la signalisation en aval1,2,3,4. Parmi ces paralogs, BRAF a la plus forte activité en raison de son Formatement phosphorylé NtA (N–terminal acidic) motif12,13,14, tandis que l’ARAF a le plus bas l’activité découlant de son motif APE non canonique15. Ceci peut expliquer les différentes fréquences de mutation des paralogs de RAF dans les maladies : BRAF-gt;CRAF-gt;ARAF. En outre, au sein du même paralog de la RAF, les mutations dans différents sites peuvent déclencher la signalisation en aval de manièredistincte, ce qui ajoute une autre couche de complexité à la régulation des kinases familiales de la RAF. Des études récentes ont démontré que toutes les kinases de la RAF ont à la fois des activités catalytiques et allostériques13,14,16,17,18. Les mutants de la RAF constitutivement actifs allument la signalisation en aval directement en phosphorylisant MEK, tandis que les mutants de la RAF morts par kinase peuvent transactiver leurs homologues de type sauvage par dimerisation d’un côté à l’autre et activer la signalisation MEK-ERK16 ,19,20. L’affinité/stabilité dimère est un paramètre clé qui détermine non seulement l’activité allostérique des mutants de la RAF morts en kinase, mais affecte également l’activité catalytique des mutants de la RAF constitutivement actifs15,21, 22. Les mutants de la RAF morts par la kinase avec une affinité/stabilité élevée de dimère peuvent transactiver les RAF endogènes de type sauvage directement15, tandis que ceux avec l’affinité/stabilité intermédiaire de dimer exigent une coordination de Ras actif ou d’un niveau élevé de molécules de type sauvage RAF pour fonctionner13,15,20,21,23. De même, les mutants de la RAF constitutivement actifs phosphoryent MEK d’une manière dimère-dépendante, et ceux avec l’affinité/stabilité faible dimère perdent leur activité catalytique in vitro sur l’immunoprécipitation qui casse les dimers faibles de RAF15,, 21,22. L’affinité/stabilité dimère détermine également la sensibilité des mutants de RAF à leurs inhibiteurs, et corrèle positivement à la résistance des inhibiteurs de RAF24. Par conséquent, pour caractériser les mutants de la RAF liés à la maladie, il est nécessaire de mesurer leurs activités catalytiques et allostériques, et l’affinité dimer / stabilité.
Ces dernières années, notre laboratoire et d’autres ont développé diverses méthodes pour caractériser les kinases de la famille RAF et leurs mutants. Selon notre laboratoire et l’expérience d’autres personnes, nous pensons que les trois essais suivants ont des avantages à définir les mutants de la RAF liés à la maladie : (1) l’analyse in vitro de la kinase qui peut être effectuée facilement pour détecter l’activité catalytique de la maladie mutants actifs de la RAF15; (2) l’analyse de co-activation de la RAF qui est une méthode fiable et pratique pour mesurer l’activité allostérique des mutants de la RAF kinase-morts13,15,21,22,23, 25; (3) l’analyse de luciferase fractionnée gratuite qui a une sensibilité beaucoup plus élevée dans la mesure de l’affinité relative dimer / stabilité des mutants DE la RAF en contraste avec l’analyse traditionnelle co-immunoprécipitation, et est capable d’effectuer sans équipement de pointe dans contraste avec les méthodes d’analyse quantitative s’ils sont telles que l’analyse SPR (Surface Plasmon Resonance)15,22. En combinant ces trois essais, nous pouvons comprendre facilement comment un mutant de la RAF lié à la maladie modifie la signalisation en aval et ainsi utiliser une stratégie thérapeutique appropriée pour traiter la maladie causée par cette mutation de la RAF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous avons présenté trois méthodes pour caractériser les mutants de la RAF liés à la maladie, qui incluent l’analyse in vitro de kinase, l’analyse de co-activation de RAF, et l’analyse fractionnée gratuite de luciferase. Puisque les kinases de RAF ont l’activité catalytique et l’activité allosteric, divers mutants de RAF peuvent activer la signalisation en aval par deux mécanismes distincts13,14,16<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient reconnaître la bourse hairy Cell Leukemia Fellowship pour le soutien de Yuan Jimin. Ce travail a été soutenu par Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), and SHF Academic Medicine Subvention de recherche (AM/TP011/2018).
Materials
| anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
| anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
| anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
| anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
| anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
| anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
| HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
| pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
| D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
| 6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
| GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |
Referências
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