JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Pesquisa do Câncer

व्यावहारिक और संभावित तरीकों का एक सेट का उपयोग करके आरएएफ परिवार Kinases के रोग से संबंधित उत्परिवर्ती विशेषता

Published: July 17, 2019
doi:
10.3791/59795
, , , , ,
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research,National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program,Duke-NUS Medical School

Summary

इस लेख में, हम आरएएफ परिवार kinases, जो इन विट्रो kinase परख, आरएएफ सह सक्रियण परख, और पूरक विभाजन luciferase परख में शामिल हैं रोग से संबंधित म्यूटेंट की विशेषता के लिए व्यावहारिक और व्यावहारिक तरीकों का एक सेट प्रस्तुत किया.

Abstract

तेजी से त्वरित फाइब्रोसार्कोमा (आरएएफ) परिवार kinases सेल जीव विज्ञान में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं और उनके रोग कैंसर और विकास संबंधी विकारों की ओर जाता है। रोग से संबंधित आरएएफ म्यूटेंट का एक लक्षण हमें इन रोगों के इलाज के लिए उपयुक्त चिकित्सीय रणनीतियों का चयन करने में मदद करेगा। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि आरएएफ परिवार kinases दोनों उत्प्रेरक और allosteric गतिविधियों, जो कसकर dimerization द्वारा विनियमित कर रहे हैं. यहाँ, हम उत्प्रेरक और allosteric गतिविधियों और RAF परिवार kinases और उनके म्यूटेंट के रिश्तेदार dimer आत्मीयता / सबसे पहले, हमने बफर्स में डिटर्जेंट एकाग्रता को कम करके, एक कोमल त्वरित धोने की प्रक्रिया का उपयोग करके, और आरएएफ डिमरकोस को अलग करने से रोकने के लिए एक ग्लूटाथियोन एस-ट्रांसफरेज़ (जीएसटी) संलयन को रोजगार देकर क्लासिक इन विट्रो किनेज़ परख में संशोधन किया। शोधन. यह हमें उचित रूप से सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट की उत्प्रेरक गतिविधि को मापने के लिए सक्षम बनाता है। दूसरे, हम एक उपन्यास आरएएफ सह सक्रियण परख एन-टर्मिनल छोटा आरएएफ प्रोटीन का उपयोग करके kinase-मृत आरएएफ उत्परिवर्ती की allosteric गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए विकसित की है, वर्तमान प्रोटोकॉल में सक्रिय रास की आवश्यकता को नष्ट करने और इस तरह एक उच्च प्राप्त करने संवेदनशीलता. अंत में, हमने विभिन्न आरएएफ म्यूटेंटकेशों के सापेक्ष द्विमर आत्मीयता/स्थिरता को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए एक अद्वितीय पूरक विभाजित ल्यूसिफेरेस परख उत्पन्न की है, जो पारंपरिक सह-प्रतिरक्षा परख की तुलना में अधिक विश्वसनीय और संवेदनशील है। सारांश में, इन विधियों के निम्न लाभ हैं: (1) उपयोगकर्ता के अनुकूल; (2) उन्नत उपकरणों के बिना प्रभावी ढंग से बाहर ले जाने में सक्षम; (3) लागत प्रभावी; (4) अत्यधिक संवेदनशील और पुन: उत्पादन ीय।

Introduction

आरएएफ परिवार kinases आरएएस / RAF/MEK/ERK संकेत झरना का एक प्रमुख घटक है, जो आरएएस से एकसंकेत संचारित mitogen-सक्रिय प्रोटीन kinase (MEK) 1,2,3,4सक्रिय करने के लिए कर रहे हैं। काइनेस का यह परिवार कोशिका विकास , अस्तित्व और भेदभाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है , और उनके परिवर्तन कई रोगों , विशेष रूप से कैंसर5,6,7,8को प्रेरित करते हैं . हाल ही में, जीनोमिक अनुक्रमणों ने कई रोग-संबंधी आरएएफ म्यूटेंटों की पहचान की है जोआरएएस/आरएएफ/एमईके/ईआरके झरना 9,10,11के संकेत संचरण में विभिन्न गुणों का प्रदर्शन करते हैं। आरएएफ म्यूटेंट की एक सावधान विशेषता हमें कैसे आरएएफ उत्परिवर्ती आरएएस के संकेत उत्पादन को बदलने के आणविक तंत्र को समझने में मदद मिलेगी / RAF/MEK/ERK झरना, अंततः विभिन्न आरएएफ उत्परिवर्ती संचालित रोगों के इलाज के लिए उपयुक्त दृष्टिकोण का चयन करें।

आरएएफ परिवार kinases तीन सदस्यों, CRAF, BRAF, और ARAF, जो इसी तरह के आणविक संरचनाओं लेकिन विभिन्न क्षमताओं को सक्रिय करने के लिए डाउनस्ट्रीम संकेतन1,2,3,4शामिल हैं. इन पैरालॉगमेंट्स में, बीआरएएफ की सबसे अधिक गतिविधि इसके गठन के कारण की जाती है , जो कि सबसे कम है (एन–टीएरमिनल एसिडिक ) आकृति12,13,14, जबकि एआरएएफ में सबसे कम है अपनी गैर-कैनोनिकल एपीई आकृति15से उत्पन्न होने वाली गतिविधि | यह रोगों में आरएएफ paralogs के विभिन्न उत्परिवर्तन आवृत्तियों की व्याख्या कर सकते हैं: BRAF और CRAF और ARAF. इसके अलावा, एक ही आरएएफ paralog के भीतर, विभिन्न साइटों में उत्परिवर्तन अलग शिष्टाचार में डाउनस्ट्रीम संकेतन ट्रिगर कर सकते हैं, जो आरएएफ परिवार kinases के विनियमन के लिए जटिलता की एक और परत कहते हैं. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि आरएएफ के सभी काइनेस में उत्प्रेरक और एलोसेटिक दोनों गतिविधियां13,14,16,17,18हैं . Contitutively सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट फॉस्फोरीलेटिंग MEK द्वारा सीधे डाउनस्ट्रीम संकेतन पर बारी है, जबकि kinase मृत आरएएफ उत्परिवर्ती पक्ष-से-साइड डिमराइजेशन के माध्यम से अपने जंगली प्रकार समकक्षों को स्थानांतरित कर सकते हैं और MEK-ERK संकेतन 16 सक्रिय करें ,19,20. dimer आत्मीयता / स्थिरता एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि न केवल kinase मृत आरएएफ उत्परिवर्ती की allosteric गतिविधि निर्धारित करता है, लेकिन यह भी गठन सक्रिय आरएएफ उत्परिवर्ती की उत्प्रेरक गतिविधि को प्रभावित करता है15,21, 22.उच्च dimer आत्मीयता के साथ kinase-मृत आरएएफ म्यूटेंट / स्थिरता अंतर्जात जंगली प्रकार RAFs सीधे15को निष्क्रिय कर सकते हैं , जबकि मध्यवर्ती dimer आत्मीयता के साथ उन / जंगली प्रकार के आरएएफ अणुओं का ऊंचा स्तर13,15,20,21,23कार्य करने के लिए । इसी प्रकार, एक dimer-निर्भर तरीके से, और कम dimer आत्मीयता के साथ उन लोगों के साथ गठन सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट फॉस्फोरीलेट MEK, और कम dimer आत्मीयता के साथ उन लोगों को प्रतिरक्षा पर विट्रो में अपनी उत्प्रेरक गतिविधि खो देते हैं कि कमजोर आरएएफ dimers टूट जाता है15, 21,22. dimer आत्मीयता / स्थिरता भी उनके inhibitors के लिए आरएएफ उत्परिवर्ती की संवेदनशीलता निर्धारित करता है, और सकारात्मक आरएएफ inhibitors24के प्रतिरोध के लिए संबंधित है. इसलिए, रोग से संबंधित आरएएफ म्यूटेंट की विशेषता के लिए, उनके उत्प्रेरक और एलोसेटिक गतिविधियों को मापने के लिए आवश्यक है, और डिमर एफ़िनिटी/

हाल के वर्षों में, हमारी प्रयोगशाला और दूसरों आरएएफ परिवार kinases और उनके म्यूटेंट की विशेषता के लिए विभिन्न तरीकों का विकास किया है। हमारी प्रयोगशाला और दूसरों के अनुभव के अनुसार, हमें लगता है कि निम्नलिखित तीन परख रोग से संबंधित आरएएफ म्यूटेंट को परिभाषित करने में लाभ है: (1) इन विट्रो kinase परख है कि आसानी से किया जा सकता है के लिए गठन की उत्प्रेरक गतिविधि का पता लगाने सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट15; (2) आरएएफ सह सक्रियण परख कि kinase मृत आरएएफ उत्परिवर्ती13,15,21,22,23, के allosteric गतिविधि को मापने के लिए एक विश्वसनीय और सुविधाजनक तरीका है, 25; (3) मानार्थ विभाजन luciferase परख है कि रिश्तेदार dimer आत्मीयता को मापने में बहुत अधिक संवेदनशीलता है / मात्रात्मक विश्लेषणात्मक विधियों जैसे एसपीआर (स्यूफेस पीलास्मोन आरएसनेंस ) विश्लेषण15,22. इन तीन परख के संयोजन, हम आसानी से समझ सकते हैं कि कैसे एक रोग से संबंधित आरएएफ उत्परिवर्ती बहाव संकेतन बदल देता है और इस तरह इस आरएएफ उत्परिवर्तन की वजह से रोग के इलाज के लिए एक उपयुक्त चिकित्सीय रणनीति का उपयोग.

Protocol

1. आरएएफ उत्परिवर्ती की उत्प्रेरक गतिविधि को मापने के लिए विट्रो काइनेज़ परख में गिब्सन असेंबली या पारंपरिक आणविक क्लोनिंग विधियों का उपयोग करके सी-टर्मिनस पर FLAG (DYKDDK) टैग के साथ आरएएफ म्यूटेंट एन?…

Representative Results

आरएएफ परिवार kinases दोनों उत्प्रेरक और allosteric गतिविधियों है, जो उनकी बीमारी से संबंधित म्यूटेंट विभिन्न तंत्र13,14,16,17 के माध्यम से बहाव संकेत पर बारी करने के लिए स?…

Discussion

इस लेख में, हम रोग से संबंधित आरएएफ म्यूटेंट, जो इन विट्रो kinase परख, आरएएफ सह सक्रियण परख, और मानार्थ विभाजन luciferase परख में शामिल विशेषता के लिए तीन तरीकों प्रस्तुत किया. चूंकि आरएएफ kinases दोनों उत्प्रेरक गतिवि?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखकयुआन Jimin के समर्थन के लिए बालों सेल Leukemia फैलोशिप स्वीकार करना चाहते हैं. यह काम एशिया फंड कैंसर रिसर्च (AFCR2017/2019-JH), ड्यूक-NUS फू ब्रिज फंडिंग अवार्ड (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF ब्रिजिंग ग्रांट (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), एनसीसीआरएफ पायलट अनुदान (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), और एस.सी.एफ.आर.एफ. अनुसंधान अनुदान (AM/TP011/2018).

Materials

anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
  2. Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
  3. Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 “kinase”. FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).
  4. Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).
  5. Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).
  6. Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).
  7. McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).
  8. Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).
  9. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
  10. Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).
  11. Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).
  12. Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).
  13. Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).
  14. Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161 (5), 967-970 (2015).
  15. Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).
  16. Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116 (6), 855-867 (2004).
  17. Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).
  18. Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).
  19. Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).
  20. Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140 (2), 209-221 (2010).
  21. Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).
  22. Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).
  23. Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).
  24. Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).
  25. Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).
  26. Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).
  27. Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  28. Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).
  29. Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Pesquisa do Câncer. 61 (9), 3595-3598 (2001).
  30. Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).
  31. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
  32. Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).
  33. Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, 289-305 (2000).
  34. Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. “RAF” neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).
  35. García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).
  36. Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).
  37. Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).
  38. Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).

Tags

RAF KinaseDisease-related MutantsCharacterizationCatalytic ActivityFlag-taggedGlutathione S-transferase293T CellsLysis BufferAnti-FLAG Affinity BeadsKinase ReactionSDS-PAGEImmunoblot
check_url/pt/59795?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image