Caracterizar Mutants relacionados à doença da família da RAF kinases usando um conjunto de métodos práticos e viáveis
Summary
Neste artigo, nós apresentamos um jogo de métodos práticos e viáveis para caracterizar mutantes doença-relacionados de kinases da família do RAF, que incluem o ensaio in vitro da quinase, o ensaio da coativação do RAF, e o ensaio rachado complementar do luciferase.
Abstract
O fibrosarcoma ràpida acelerado (RAF) quinases da família jogam um papel central na biologia de pilha e sua deficiência orgânica conduz aos cancros e às desordens desenvolventes. Uma caracterização de mutantes da RAF relacionados à doença nos ajudará a selecionar estratégias terapêuticas apropriadas para o tratamento dessas doenças. Estudos recentes mostraram que as cinases familiares da RAF têm atividades catalíticas e aloestericas, que são fortemente reguladas por dimerização. Aqui, construímos um conjunto de métodos práticos e viáveis para determinar as atividades catalíticas e aloestericas e a afinidade/estabilidade do dímero relativo das cinases familiares da RAF e seus mutantes. Em primeiro lugar, alteramos o ensaio de quinase in vitro clássico, reduzindo a concentração de detergente em buffers, utilizando um procedimento de lavagem rápida suave, e empregando uma fusão de glutationa S-transferase (GST) para evitar que os dímeros da RAF se dissociem durante Purificação. Isto permite-nos de medir apropriadamente a atividade catalítica de mutantes constitutivamente ativos da RAF. Em segundo lugar, nós desenvolvemos um ensaio novo da coativação do RAF para avaliar a atividade alostérico de mutantes da RAF da quinase-inoperante usando proteínas truncadas do RAF do N-terminal, eliminando a exigência de Ras ativas em protocolos atuais e conseguindo desse modo um mais elevado Sensibilidade. Finalmente, nós geramos um único ensaio complementar da luciferase da separação para medir quantitativamente a afinidade/estabilidade do dímero relativo de vários mutantes do RAF, que é mais de confiança e sensível comparado ao ensaio tradicional da co-imunoprecipitação. Em resumo, esses métodos têm as seguintes vantagens: (1) fácil de usar; (2) capaz de realizar eficazmente sem equipamento avançado; (3) custo-eficaz; (4) altamente sensível e reprodutível.
Introduction
As quinases da família RAF são um componente chave da cascata de sinalização Ras/Raf/MEK/Erk, que transmitem um sinal de RAS para ativar a proteína quinase ativada por mitogen (MEK)1,2,3,4. Esta família de quinases desempenha um papel crucial no crescimento celular, sobrevivência e diferenciação, e suas alterações induzem muitas doenças, notadamente o câncer5,6,7,8. Recentemente, os sequenciamentos de Genomic identificaram muitos mutantes doença-relacionados do RAF que exibem propriedades diferentes na transmissão do sinal de Ras/Raf/MEK/Erk cascata9,10,11. Uma caracterização cuidadosa dos mutantes da RAF nos ajudará a entender os mecanismos moleculares de como os mutantes da RAF alteram a saída de sinal da cascata RAS/RAF/MEK/ERK, eventualmente selecionam abordagens apropriadas para o tratamento de várias doenças movidas por mutantes da RAF.
As quinases da família RAF incluem três membros, CRAF, BRAF e Araf, que têm estruturas moleculares semelhantes, mas diferentes habilidades para ativar a sinalização a jusante1,2,3,4. Entre estes paralogs, braf tem a atividade a mais elevada em virtude de seu Motif constitutivamente fosforilada NTA (N–tirtual umcidic)12,13,14, quando Araf tiver o mais baixo atividade decorrente de seu motivo não canônico APE15. Isto pode explicar as freqüências diferentes da mutação de de do RAF nas doenças: BRAF > CRAF > Araf. Além disso, dentro do mesmo paralog do RAF, as mutações em locais diferentes podem provocar a sinalização a jusante em maneiras distintas, que adiciona uma outra camada de complexidade à regulação de kinases da família do RAF. Estudos recentes demonstraram que todas as cinases da RAF têm atividades catalíticas e alopestericas13,14,16,17,18. Mutantes constitutivamente ativos da RAF giram sobre a sinalização a jusante diretamente pela fosforilação MEK, enquanto os mutantes da RAF quinase-Dead podem transacionar seus homólogos do tipo selvagem através da dimerização lado a lado e ativar a sinalização de MEK-ERK16 ,19,20. A afinidade/estabilidade do dímero é um parâmetro-chave que não só determina a atividade alostômica de mutantes da RAF de quinase morta, mas também afeta a atividade catalítica de mutantes da RAF constitutivamente ativos15,21, 22. a quinase-mortos RAF mutantes com alta afinidade de dímero/estabilidade pode transacionar o Wild-Type endógena rafs diretamente15, enquanto aqueles com intermediário dímero afinidade/estabilidade requer uma coordenação de Ras ativas ou um nível elevado de moléculas de RAF do tipo selvagem para funcionar13,15,20,21,23. Similarmente, mutantes constitutivamente ativos do RAF fosforilar MEK em uma maneira dímero-dependente, e aqueles com baixa afinidade/estabilidade do dímero perdem sua atividade catalítica in vitro em cima da imunoprecipitação que quebra os dímeros fracos do RAF15, 21,22. A afinidade/estabilidade do dímero também determina a sensibilidade dos mutantes da RAF aos seus inibidores e correlaciona-se positivamente com a resistência dos inibidores da RAF24. Portanto, para caracterizar os mutantes da RAF relacionados à doença, é necessário medir suas atividades catalíticas e aloestericas e afinidade/estabilidade de dímero.
Nos últimos anos, nosso laboratório e outros desenvolveram vários métodos para caracterizar as cinases da família RAF e seus mutantes. De acordo com o nosso laboratório e a experiência dos outros, pensamos que os três ensaios seguintes têm vantagens na definição de mutantes da RAF relacionados com a doença: (1) o ensaio in vitro quinase que pode ser realizado com facilidade para detectar a atividade catalítica de constitutivamente mutantes ativos da RAF15; (2) o ensaio da co-ativação do RAF que é um método confiável e conveniente para medir a atividade alostérico de mutantes da quinase-inoperante RAF13,15,21,22,23, de 25; (3) o ensaio de luciferase de divisão complementar que tem sensibilidade muito maior na medição da afinidade/estabilidade do dímero relativo dos mutantes da RAF em contraste com o ensaio de co-imunoprecipitação tradicional, e é capaz de realizar sem equipamentos avançados em contraste com os métodos analíticos quantitativos como a análise de SPR (Surface Plasmon Resonance)15,22. Combinando estes três ensaios, nós podemos compreender facilmente como um mutante doença-relacionado da RAF altera a sinalização a jusante e utiliza desse modo uma estratégia terapêutica apropriada para tratar a doença causada por esta mutação do RAF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, nós apresentamos três métodos para caracterizar Mutants doença-relacionados do RAF, que incluem o ensaio in vitro da quinase, o ensaio da coativação do RAF, e o ensaio rachado complementar do luciferase. Uma vez que a RAF quinases tem atividade catalítica e atividade alostômica, vários mutantes da RAF podem ativar a sinalização a jusante através de dois mecanismos distintos13,14,16,<sup class…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer a bolsa de leucemia de células peludas para o apoio de Yuan Jimin. Este trabalho foi apoiado pela Ásia fundo Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge financiamento Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF Bridging Grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF Pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), e SHF medicina acadêmica Subvenção à investigação (AM/TP011/2018).
Materials
| anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
| anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
| anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
| anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
| anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
| anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
| HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
| pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
| D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
| 6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
| GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |
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