В этой статье мы представили набор практических и осуществимых методов для характеристики связанных с болезнями мутантов семейных киназ RAF, которые включают в себя анализ in vitro киназы, анализ совместной активации RAF и дополнительный анализ сплит-люциферазы.
Быстро ускоренная фиброзаркома (RAF) семейные киназы играют центральную роль в клеточной биологии и их дисфункция приводит к раку и нарушениям развития. Характеристика связанных с болезнями мутантов RAF поможет нам выбрать соответствующие терапевтические стратегии для лечения этих заболеваний. Недавние исследования показали, что семейные киназы RAF имеют как каталитическую, так и аллостерную деятельность, которая жестко регулируется димеризацией. Здесь мы построили набор практических и осуществимых методов для определения каталитической и аллостерической деятельности и относительной сродства/стабильности киназов семейства RAF и их мутантов. Во-первых, мы внесли изменения в классический анализ in vitro kinase, снизив концентрацию моющего средства в буферах, используя нежную процедуру быстрой стирки и используя фьюжн-передатчик (GST) для предотвращения разъединения RAF димеров во время Очистки. Это позволяет адекватно измерять каталитическую активность constitutively активных мутантов RAF. Во-вторых, мы разработали новый RAF совместной активации анализ для оценки аллостерической активности киназы мертвых мутантов RAF с помощью N-терминала усеченных белков RAF, устраняя требование активного Раса в текущих протоколах и тем самым достигая более высокого Чувствительность. Наконец, мы создали уникальный дополнительный анализ разделенной люциферазы для количественного измерения относительной сродства/стабильности различных мутантов RAF, которая является более надежной и чувствительной по сравнению с традиционным анализом совместного иммунопреципиции. Таким образом, эти методы имеют следующие преимущества: (1) удобный для пользователя; (2) в состоянии эффективно осуществлять без современного оборудования; (3) рентабельно; (4) очень чувствительны и воспроизводимы.
Семейные киназы RAF являются ключевым компонентом каскада сигнализации RAS/RAF/MEK/ERK, которые передают сигнал от РАН для активации митоген-активированного протеина киназы (MEK)1,2,3,4. Это семейство киназ играет решающую роль в росте клеток, выживании и дифференциации, и их изменения вызывают многие заболевания, в частности, рак5,6,7,8. В последнее время геномные секвенирования выявили много связанных с болезнью мутантов RAF, которые обладают различными свойствами в передаче сигнала RAS/RAF/MEK/ERK каскад9,10,11. Тщательная характеристика мутантов RAF поможет нам понять молекулярные механизмы того, как мутанты RAF изменяют сигнальный выход каскада RAS/RAF/MEK/ERK, в конечном итоге выбирая подходящие подходы для лечения различных мутантов, управляемых RAF.
Семьи киназы RAF включают в себя три члена, CRAF, BRAF, и ARAF, которые имеют аналогичные молекулярные структуры, но различные способности, чтобы активировать вниз по течению сигнализации1,2,3,4. Среди этих паралогов, BRAF имеет самую высокую активность в силу своей составно фосфорилированной NtA (N–тerminal cidic) мотив12,13 ,14, в то время как ARAF имеет самый низкий деятельность, вытекающая из его неканонического мотива APE15. Это может объяснить различные частоты мутаций паралогов RAF при заболеваниях: BRAF-gt;CRAF-gt;ARAF. Кроме того, в рамках одного и того же паралога RAF мутации на разных участках могут вызывать сигнализацию вниз по течению в различных манерах, что добавляет еще один уровень сложности к регулированию семейных киназ RAF. Недавние исследования показали, что все киназы RAF имеют как каталитическую, так и аллостерную деятельность13,14,16,17,18. В соответствии с действующими мутантами RAF включить вниз по течению сигнализацию непосредственно фосфорилирование МЭК, в то время как киназы мертвых мутантов RAF могут трансактивировать свои аналоги дикого типа через боковую-стороннюю димеризацию и активировать MEK-ERK сигнализации16 ,19,20. Димер сродство / стабильность является ключевым параметром, который не только определяет аллостерную активность киназы мертвых мутантов RAF, но и влияет на каталитическую активность constitutively активных мутантов RAF15,21, 22. Киназа-мертвые мутанты RAF с высоким dimer сродством/стабильностью могут transactivate endogenous wild-type RAFs сразу15, пока те с промежуточными dimer сродством/стабильностью требует координации активного Ras или повышенный уровень молекул RAF дикого типа для функции13,15,20,21,23. Аналогичным образом, в совокупности активных raf мутантов фосфорилат MEK в димер-зависимым образом, и те, с низким димер омрачитель близость / стабильность теряют свою каталитическую активность в пробирке на иммунопрециптом, что перерывы слабых RAF dimers15, 21,22. Димер сродство / стабильность также определяет чувствительность raf мутантов к их ингибиторы, и положительно коррелирует с сопротивлением ингибиторов RAF24. Поэтому, чтобы охарактеризовать связанные с болезнями мутанты RAF, необходимо измерить их каталитическую и аллостерную деятельность, а также димерную сродство/стабильность.
В последние годы наша лаборатория и другие разработали различные методы для характеристики семейства киназов RAF и их мутантов. Согласно нашему опыту лаборатории и другим, мы считаем, что следующие три анализа имеют преимущества в определении связанных с болезнью мутантов RAF: (1) анализ in vitro киназы, который может быть проведен с легкостью для обнаружения каталитическая активность составно активные мутанты RAF15; (2) RAF совместноактивации ассс, который является надежным и удобным методом для измерения аллостерической активности киназы мертвых мутантов RAF13,15,21,22,23, 25; (3) бесплатный анализ разделенной люциферазы, который имеет гораздо более высокую чувствительность в измерении относительной сродства димера/стабильности мутантов RAF в отличие от традиционного совместного иммунопреципции, и способен осуществлять без передового оборудования в в отличие от количественных аналитических методов, таких как SPR (Surface Plasmon Resonance) анализ15,22. Сочетая эти три анализа, мы можем легко понять, как связанные с болезнью RAF мутант изменяет вниз по течению сигнализации и тем самым использовать соответствующую терапевтическую стратегию для лечения болезни, вызванной этой мутации RAF.
В этой статье мы представили три метода для характеристики связанных с болезнями мутантов RAF, которые включают в пробирке киназы анализ, RAF совместной активации анализа, и бесплатный анализ раскола luciferase. Так как киназы RAF имеют как каталитическую активность, так и аллостерическую актив…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы отметить волосатые клетки лейкемии стипендий для поддержки Yuan Jimin. Эта работа была поддержана Азиатского фонда онкологических исследований (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Мост Финансирование премии (Дюк-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF преодоление гранта (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF пилотный грант (NCCRF-YR2017-PG- Исследовательский грант (AM/TP011/2018).
anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |