Caracterizar Mutants relacionados à doença da família da RAF kinases usando um conjunto de métodos práticos e viáveis

Resumo

Neste artigo, nós apresentamos um jogo de métodos práticos e viáveis para caracterizar mutantes doença-relacionados de kinases da família do RAF, que incluem o ensaio in vitro da quinase, o ensaio da coativação do RAF, e o ensaio rachado complementar do luciferase.

Resumo

O fibrosarcoma ràpida acelerado (RAF) quinases da família jogam um papel central na biologia de pilha e sua deficiência orgânica conduz aos cancros e às desordens desenvolventes. Uma caracterização de mutantes da RAF relacionados à doença nos ajudará a selecionar estratégias terapêuticas apropriadas para o tratamento dessas doenças. Estudos recentes mostraram que as cinases familiares da RAF têm atividades catalíticas e aloestericas, que são fortemente reguladas por dimerização. Aqui, construímos um conjunto de métodos práticos e viáveis para determinar as atividades catalíticas e aloestericas e a afinidade/estabilidade do dímero relativo das cinases familiares da RAF e seus mutantes. Em primeiro lugar, alteramos o ensaio de quinase in vitro clássico, reduzindo a concentração de detergente em buffers, utilizando um procedimento de lavagem rápida suave, e empregando uma fusão de glutationa S-transferase (GST) para evitar que os dímeros da RAF se dissociem durante Purificação. Isto permite-nos de medir apropriadamente a atividade catalítica de mutantes constitutivamente ativos da RAF. Em segundo lugar, nós desenvolvemos um ensaio novo da coativação do RAF para avaliar a atividade alostérico de mutantes da RAF da quinase-inoperante usando proteínas truncadas do RAF do N-terminal, eliminando a exigência de Ras ativas em protocolos atuais e conseguindo desse modo um mais elevado Sensibilidade. Finalmente, nós geramos um único ensaio complementar da luciferase da separação para medir quantitativamente a afinidade/estabilidade do dímero relativo de vários mutantes do RAF, que é mais de confiança e sensível comparado ao ensaio tradicional da co-imunoprecipitação. Em resumo, esses métodos têm as seguintes vantagens: (1) fácil de usar; (2) capaz de realizar eficazmente sem equipamento avançado; (3) custo-eficaz; (4) altamente sensível e reprodutível.

Introdução

As quinases da família RAF são um componente chave da cascata de sinalização Ras/Raf/MEK/Erk, que transmitem um sinal de RAS para ativar a proteína quinase ativada por mitogen (MEK)^1,2,3,4. Esta família de quinases desempenha um papel crucial no crescimento celular, sobrevivência e diferenciação, e suas alterações induzem muitas doenças, notadamente o câncer^5,6,7,8. Recentemente, os sequenciamentos de Genomic ident....

Protocolo

1. ensaio in vitro quinase para medir a atividade catalítica de mutantes da RAF

1. Construa vetores codificando mutantes da RAF (Figura 1a) com tag Flag (dykddddk) no C-Terminus usando o conjunto Gibson ou métodos tradicionais de clonagem molecular.
   1. Introduza o Tag e as mutações da bandeira nas seqüências de codificação do RAF por PCRs, e insira então seqüências inteiras no vetor do pCDNA 3.1 (+) usando o conjunto de Gibson ou a ligadura do ADN T4 e seguindo os protocolos da manufatura. Use as seguintes condições para reações de PCR: (1) 95 ° c, 2 min; (2) 95 ° c, 30 s; (3) 59 ° c, 30 s; (4) 68 ° c, 3 min....

Resultados

As quinases da família RAF têm atividades catalíticas e aloestericas, que permitem que seus mutantes relacionados à doença ativem a sinalização a jusante através de diferentes mecanismos^{13,14,16,17 ,18}. Os mutantes da RAF constitutivamente ativos fosforilar diretamente seus substratos, enquanto os mutantes da RAF quinase-Dead cumprem sua função através da tra.......

Discussão

Neste artigo, nós apresentamos três métodos para caracterizar Mutants doença-relacionados do RAF, que incluem o ensaio in vitro da quinase, o ensaio da coativação do RAF, e o ensaio rachado complementar do luciferase. Uma vez que a RAF quinases tem atividade catalítica e atividade alostômica, vários mutantes da RAF podem ativar a sinalização a jusante através de dois mecanismos distintos^13,14,16,17

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
anti-phosphoERK1/2	Cell Signaling Technologies	4370
anti-phosphoMEK1/2	Cell Signaling Technologies	9154
anti-ERK1/2	AB clonal	A0229
anti-MEK1/2	Cell Signaling Technologies	9124
anti-FLAG (mouse)	Sigma-Aldrich	F3165
anti-HA	Novus Biologicals	MAB6875
anti-FLAG (Coelho)	Cell Signaling Technologies	14793
anti-β-actina	Sigma-Aldrich	A2228
contas anti-FLAG (M2)	Sigma-Aldrich	A4596
HRP-conjugado anti-mouse IgG	Jackson Laboratories	115-035-003
HRP-conjugado IgG anti-coelho	Jackson Laboratories	111-035-144
pcDNA3.1(+)	In vitrogen	V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit	New England Biolabs	E5510
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Fugene 6	Roche	11 814 443 001
DMEM sem vermelho de fenol	Invitrogen	21063-029
D-luciferina	GoldBio	LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)	preparado em nossos estudos anteriores	N.A.	Referência 15.
Sistema de detecção GloMax-Multi.	Promega	E7041