E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성
Summary
여기에 제시된 것은 고밀도 도금 뉴런으로부터 신경 전구 세포에서 농축된 신경구의 자발적인 생성을 위한 프로토콜이다. 동일한 실험 동안, 뉴런은 낮은 밀도에서 도금 될 때, 프로토콜은 또한 장기간된 기본 쥐 신경 배양 결과.
Abstract
1 차적인 신경 문화는 신경 과학의 필드에 있는 필수적인 기술입니다. 두뇌에 더 깊은 기계론적 통찰력을 얻으려면, 각종 신경생물학 연구 결과를 위해 이용될 수 있는 강력한 시험관내 모형이 필수적입니다. 비록 기본 신경 문화 (즉, 장기 해 마 문화) 모델 과학자를 제공 했습니다., 그것은 아직 완전히 뇌 네트워크의 복잡성을 대표 하지 않습니다. 이러한 한계의 여파로, 새로운 모델은 신경 구를 사용하여 등장했다, 이는 뇌 조직에 가까운 유사성을 곰. 본 프로토콜은 배아일 14-16 스프라그 다울리 래트의 배아로부터 분리된 혼합 된 피질 및 해마 뉴런의 높고 낮은 밀도의 도금을 기술한다. 이것은 추가 연구를 수행하기 위하여 2개의 독립적인 적인 단자로 신경구 및 장기 1 차적인 신경 문화의 생성을 허용합니다. 이 과정은 매우 간단 하 고 비용 효율적인, 그것은 여러 단계를 최소화 하 고 시약 이전에 신경 문화에 대 한 필수적인 것으로 간주. 이것은 달성 가능한 결과로 수행 될 수 있고 신경 과학과 관련된 다양한 연구에 더 많이 사용될 수있는 최소한의 요구 사항을 가진 강력한 프로토콜입니다.
Introduction
뇌는 신경 세포와 비 신경 세포의 복잡 한 회로. 수년 동안 과학자들은 이 복잡한 기계에 대한 통찰력을 얻기 위해 노력해 왔습니다. 이렇게 하기 위하여는, 신경 과학자는 처음에 조사를 위한 각종 변형된 신경 기지를 둔 세포주에 의지했습니다. 그러나, 이러한 클론 세포주무능력은 강한 시냅스 연결과 적절한 축산 또는 모수석을 형성하는 데 1차뉴런 배양에 대한 과학적 관심을 1,2로이동시켰다. 1 차적인 신경 문화의 가장 흥미로운 양상은 살아있는 신경세포를 관찰하고 조작할 수 있는 기회를 만든다는 것입니다3. 또한, 그것은 신경 조직에 비해 덜 복잡 한, 기능 및 다양 한 신경 단백질의 전송을 공부 하기 위한 이상적인 후보. 최근, 현미경 검사법, 유전체학 및 프로테오믹스 분야의 여러 발전은 신경 과학자들이 신경 문화를 악용할 수 있는 새로운 기회를 창출했습니다4.
1 차적인 문화는 신경 발달의 뒤에 분자 기계장치를 탐구하고, 각종 신경 신호 통로를 분석하고, 시냅스의 더 일관된 이해를 개발하는 신경과학자를 허용했습니다. 여러 가지 방법이 1차 뉴런으로부터의 배양을 보고했지만(대부분 해마기원5,6,7),뉴런의 장기 배양을 가능하게 하는 화학적으로 정의된 배지를 가진 통합 프로토콜은 여전히 필요합니다. 그러나, 저밀도에서 도금된 뉴런은 인접 한 뉴런 및 신경교 세포에 의해 제공되는 영양 지지부 8의 부족으로 인해 장기적으로 생존하지 못하는 가장 자주 관찰된다. 일부 방법은 심지어 신경교 세포를 가진 1 차적인 신경세포의 공동 배양제안했습니다, 여기서 신경교세포는 피더 층 9로 이용됩니다. 그러나, 신경교 세포는 때때로 신경 성장10을재정의하는 그들의 자라난 때문에 많은 문제를 제기합니다. 따라서, 위의 문제를 고려, 간단 하 고 더 비용 효율적인 기본 신경 문화 프로토콜 필요, 조사에 대 한 신경 생물학자와 신경 화학자 모두에 의해 사용할 수 있는.
1 차적인 신경 문화는 본질적으로 2D 문화의 한 형태이고 두뇌의 가소성, 공간 무결성, 또는 이질성을 나타내지 않습니다. 이것은 신경구11,12에게불린 더 믿을 수 있는 3D 모형을 위한 필요를 초래했습니다. 신경구는 신경 과학자에게 새로운 플랫폼을 제시, 실제에 가까운 유사, 생체 내 뇌13. 신경구는 신경 줄기 세포 (NSC), 신경 전구 세포 (NPC), 뉴런 및 성상 세포가 풍부한 세포의 비 부착 3D 클러스터입니다. 그들은 신경 줄기 세포와 신경 전구 세포의 격리에 대 한 훌륭한 소스, 다양 한 신경 및 비 신경 계보로 분화를 공부 하는 데 사용할 수 있는. 다시, 이전에 보고된 프로토콜을 사용하여 생성된 신경구 배양 내의 가변성은 통합된신경구 배양 프로토콜(14)의 제형에 장벽을 제시한다.
이 원고는 혼합 된 피질 및 해마 배양으로부터 세포 도금 밀도를 번갈아 가며 2D 및 3D 플랫폼을 모두 생성 할 수있는 프로토콜을 제시합니다. 그것은 이내 7 일 자유 부동 신경구는 E14-E16 Sprague Dawley 쥐 배아에서 분리된 고밀도 도금 뉴런에서 얻어진다는 것을 관찰됩니다, 이는 추가 문화에 따라, 방사형 신경교와 같은 확장을 통해 다리와 상호 연결을 형성합니다. 유사하게, 저밀도 도금 뉴런에서, 최대 30일 동안 유지될 수 있는 1차 뉴런 배양은 일주일에 두 번 유지 배지를 변경함으로써 수득된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 1차 뉴런의 세포 도금 밀도를 변경함으로써, 2개의 가변 뉴런 플랫폼이 수득되는 방법을 설명한다. 이것은 간단한 방법이지만 원하는 결과를 얻으려면 각 단계를 세심하게 수행해야합니다. 다른 이전 방법 중 장기 기본 신경 문화 또는 신경 구 배양 보고. 대부분의 기본 신경 문화 프로토콜에 대 한 해 마 뉴런의 배양을 포함 했다 3-5 주, 하지만 대부분 실패, 뉴런 죽고 연결의 손실로…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 CSIR-IICB 동물 시설에 감사드립니다. G. D. 감사 ICMR, J. K. 및 V. G. DST 영감 감사, D. M. 그들의 동료에 대 한 인도 DBT 감사. S. G. 친절 하게 SERB (EMR/2015/002230) 재정 지원을 제공 하는 인도를 인정 합니다.
Materials
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
Referências
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G. . Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
- Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).
- Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
- Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
- Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
- Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
- Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
- Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449 (2014).
- Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
- Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
- Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).
- Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
- Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
