从E14-E16斯普拉格·道利大鼠胚胎分离的混合原发希马和皮质神经元生成神经球
Summary
这里介绍的是一个协议，用于从高密度镀电神经元中神经祖细胞中富集的神经球的自发生成。在同一实验中，当神经元以较低的密度被镀层时，该协议也会导致长期原发性大鼠神经元培养。
Abstract
初级神经元培养是神经科学领域必不可少的技术。为了获得对大脑的更深层次的机械洞察力，必须有一个强大的体外模型，可用于各种神经生物学研究。虽然原始神经元培养（即长期海马文化）为科学家提供了模型，但它还不能完全代表大脑网络的复杂性。在这些限制之后，一个新的模型出现了使用神经球，这与脑组织有更密切的相似之处。本协议描述了从胚胎第14-16天斯普拉格道利大鼠胚胎中分离出来的混合皮质和海马神经元的高密度和低密度的电镀。这允许产生神经球和长期初级神经元培养作为两个独立的平台进行进一步研究。这个过程非常简单且经济高效，因为它最大限度地减少了以前被认为对神经元培养至关重要的几个步骤和试剂。这是一个强大的协议，具有最低要求，可以执行与可实现的结果，并进一步用于与神经科学相关的各种研究。
Introduction
大脑是神经元和非神经元细胞的复杂回路。多年来，科学家们一直试图深入了解这种复杂的机器。为此，神经科学家最初利用各种转化的神经基细胞系进行调查。然而，这些克隆细胞系无法形成强突触连接和适当的斧子或树突，转移了科学兴趣的主要神经元培养1，2。原始神经元文化最令人兴奋的方面是，它创造了观察和操纵活神经元的机会3。此外，与神经组织相比，它不太复杂，因此成为研究各种神经元蛋白质的功能和传输的理想候选者。最近，显微镜、基因组学和蛋白质组学领域的一些发展为神经科学家创造了利用神经元培养的新机会。
初级文化使神经科学家能够探索神经发育背后的分子机制，分析各种神经信号通路，并发展对突触的更连贯的理解。虽然许多方法已经报告了来自主神经元的培养物（主要来自海马起源5，6，7），但具有化学定义的介质的统一协议是，使神经元的长期培养仍然需要。然而，在低密度下镀层的神经元最常被观察到，这些神经元不能长期存活，这可能是由于缺乏营养支持8，而营养支持是由相邻的神经元和胶质细胞提供的。一些方法甚至建议与胶质细胞共同培养主神经元，其中胶质细胞用作第9层的供料层。然而，胶质细胞由于过度生长而引起许多问题，有时会覆盖神经元的生长。因此，考虑到上述问题，需要一种更简单、更具成本效益的初级神经培养方案，神经生物学家和神经化学家都可以用于研究。
初级神经元文化本质上是一种二维文化形式，并不代表大脑的可塑性、空间完整性或异质性。这就产生了一个更可信的3D模型，称为神经球11，12的需要。神经球为神经科学家提供一个新颖的平台，与真正的、体内的大脑更相似。神经球是富含神经干细胞（NSC）、神经祖细胞（NPC）、神经元和星形细胞的非粘附性3D细胞簇。它们是神经干细胞和神经祖细胞分离的极好来源，可用于研究各种神经元和非神经元谱系的分化。同样，使用先前报告的协议产生的神经圈培养物的变异性对制定统一的神经圈培养方案14构成了障碍。
本手稿提出了一个协议，通过从混合皮质和海马培养中交替细胞电镀密度，可以生成 2D 和 3D 平台。据观察，在7天内，自由浮动的神经球是从从E14-E16斯普拉格道利大鼠胚胎中分离出来的高密度镀层神经元中获得的，这些神经元在进一步培养后，通过径向胶质状的延伸形成桥梁和互连。同样，在低密度镀层神经元中，通过每周两次改变维持介质，可以维持长达30天的主要神经元培养。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议描述了如何通过改变主神经元的细胞电镀密度，获得两个可变神经元平台。虽然这是一个简单的方法，但必须仔细执行每个步骤才能达到预期的结果。其他以前的方法要么报告长期原发神经元培养或神经圈培养。大多数主要神经元培养协议都涉及海马神经元的培养3-5周，但大多数已经失败，因为神经元死亡和枯萎，由于失去连接。该协议的另一个优点是，神经元可以培养，而无需任何胶质?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢CSIR-IICB动物设施。G. D. 感谢ICMR、J.K.和V.G.感谢DST Inspire，D.M.感谢印度DBT的奖学金。S. G. 请确认 SERB （EMR/2015/002230） 印度提供财政支持。
Materials
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
Referências
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