Generatie van neuro sferen van gemengde primaire Hippocampal en corticale neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo
Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor de spontane generatie van neuro sferen verrijkt in neurale voorlopercellen uit hoge dichtheid vergulde neuronen. Tijdens hetzelfde experiment, wanneer neuronen worden verguld met een lagere dichtheid, het protocol resulteert ook in langdurige primaire rat neuron culturen.
Abstract
Primaire neuron cultuur is een essentiële techniek op het gebied van de neurowetenschappen. Om diepere mechanistische inzichten in de hersenen te krijgen, is het essentieel om een robuust in vitro model te hebben dat kan worden misbruikt voor verschillende neurobiologie studies. Hoewel primaire neuron culturen (dat wil zeggen, lange termijn hippocampal culturen) hebben wetenschappers voorzien van modellen, het is nog niet de complexiteit van het hersen netwerk volledig vertegenwoordigen. In het kielzog van deze beperkingen, een nieuw model is ontstaan met behulp van neuro sferen, die een nauwere gelijkenis met het hersenweefsel draagt. Het huidige protocol beschrijft de beplating van hoge en lage dichtheid van gemengde corticale en hippocampal neuronen geïsoleerd van het embryo van embryonale dag 14-16 Sprague Dawley ratten. Dit maakt het mogelijk voor de generatie van neuro sferen en de lange termijn primaire neuron cultuur als twee onafhankelijke platforms om verdere studies uit te voeren. Dit proces is zeer eenvoudig en kosteneffectief, omdat het minimaliseert verschillende stappen en reagentia eerder beschouwd als essentieel voor neuron cultuur. Dit is een robuust protocol met minimale vereisten die kunnen worden uitgevoerd met haalbare resultaten en verder worden gebruikt voor een verscheidenheid aan studies met betrekking tot neurowetenschappen.
Introduction
De hersenen is een ingewikkelde circuits van neuronale en niet-neuronale cellen. Al jaren proberen wetenschappers inzicht te verwerven in deze complexe machines. Om dit te doen, neurowetenschappers aanvankelijk toevlucht genomen tot verschillende getransformeerde zenuw-gebaseerde cellijnen voor onderzoeken. Echter, het onvermogen van deze klonale cellijnen om sterke synaptische verbindingen en goede axonen of dendrites te vormen hebben de wetenschappelijke belangstelling verschoven naar primaire neuron culturen1,2. Het meest opwindende aspect van de primaire neuron cultuur is dat het een kans creëert om levende neuronen3te observeren en te manipuleren. Bovendien, het is minder complex in vergelijking met zenuwweefsel, waardoor het een ideale kandidaat voor het bestuderen van de functie en het vervoer van verschillende neuronale eiwitten. Onlangs hebben verschillende ontwikkelingen op het gebied van microscopie, Genomics en proteomica nieuwe mogelijkheden voor neurowetenschappers opgeleverd om neuron culturen4te exploiteren.
Primaire culturen hebben neurowetenschappers toegestaan om de moleculaire mechanismen achter neurale ontwikkeling te verkennen, verschillende neurale signalerings trajecten te analyseren en een meer samenhangend begrip van Synapsis te ontwikkelen. Hoewel een aantal methoden hebben gerapporteerd culturen van primaire neuronen (meestal uit de hippocampal oorsprong5,6,7), een uniform protocol met een chemisch gedefinieerd medium dat de lange termijn cultuur van neuronen maakt is nog steeds nodig. Echter, neuronen verguld met een lage dichtheid worden meestal waargenomen, die niet overleven op lange termijn, waarschijnlijk te wijten aan het gebrek aan trofische ondersteuning8 die wordt geleverd door de aangrenzende neuronen en gliacellen. Sommige methoden hebben zelfs voorgesteld co-culturing van de primaire neuronen met gliacellen, waarbij de gliacellen worden gebruikt als een feeder Layer9. Echter, gliacellen vormen een heleboel problemen als gevolg van hun overmatige groei, die soms de neuronale groei10overschrijven. Vandaar, gezien de bovenstaande problemen, een eenvoudigere en meer kosteneffectieve primaire neurale cultuur protocol is vereist, die kan worden gebruikt door zowel neuro biologen en neuro chemici voor onderzoeken.
Een primaire neuron cultuur is in wezen een vorm van 2D cultuur en vertegenwoordigt niet de plasticiteit, ruimtelijke integriteit, of heterogeniteit van de hersenen. Dit heeft aanleiding gegeven tot de noodzaak van een geloofwaardiger 3D-model genaamd neuro sferen11,12. Neuro sferen presenteren een nieuw platform aan neurowetenschappers, met een nauwere gelijkenis met de echte, in vivo hersenen13. Neuro sferen zijn niet-aanhankelijke 3D-clusters van cellen die rijk zijn aan neurale stamcellen (NSCs), neurale voorlopercellen (Npc’s), neuronen en astrocyten. Ze zijn een uitstekende bron voor de isolatie van neurale stamcellen en neurale voorlopercellen, die kunnen worden gebruikt om differentiatie te bestuderen in verschillende neuronale en niet-neuronale kilometerstanden. Opnieuw, variabiliteit binnen neurosphere culturen geproduceerd met behulp van de eerder gerapporteerde protocollen presenteert een barrière voor de formulering van een uniforme neurosphere Culture protocol14.
Dit manuscript presenteert een protocol waarin het mogelijk is om zowel 2D-als 3D-platforms te genereren door de dichtheden van celplating te wisselen van een gemengde corticale en hippocampal-cultuur. Het is waargenomen dat binnen 7 dagen vrij-zwevende neuro sferen worden verkregen uit hoge dichtheid vergulde neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo, die bij verdere cultuur, vormen bruggen en interconnecties door middel van radiale glial-achtige extensies. Evenzo, in de lage dichtheid vergulde neuronen, een primaire neuron cultuur die kan worden gehandhaafd voor maximaal 30 dagen wordt verkregen door het wijzigen van het onderhouds medium twee keer per week.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft dat hoe door het veranderen van de celplating dichtheden van primaire neuronen, twee variabele neuronale platformen worden verkregen. Hoewel dit een eenvoudige methode is, moet elke stap nauwgezet worden uitgevoerd om de gewenste resultaten te bereiken. Andere voorgaande methoden hebben ofwel gemeld op lange termijn primaire neuron culturen of neurosphere culturen. De meeste primaire neuron cultuur protocollen hebben betrokken de kweek van hippocampal neuronen voor 3-5 weken, maar de meeste hebben…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken CSIR-IICB Animal Facility. G. D. Bedankt ICMR, J. K. en V. G. Thank DST INSPIRE, en D. M. Thanks DBT, India voor hun Fellowships. S. G. erkent SERB (EMR/2015/002230) India om financiële steun te verlenen.
Materials
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
Referências
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G. . Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
- Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).
- Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
- Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
- Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
- Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
- Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
- Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449 (2014).
- Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
- Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
- Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).
- Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
- Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
